利用酵母双杂交系统筛选与G蛋白及CaM相互作用的新蛋白--《河北师范大学》2003年博士论文
利用酵母双杂交系统筛选与G蛋白及CaM相互作用的新蛋白
【摘要】：
酵母双杂交系统是近年来发展起来的一种研究蛋白质—蛋白质相互作用的有效方法，由于它检测的是一种体内的相互作用，自这一系统建立以来，就被广泛地应用于生命研究的各个领域。在植物信号转导领域中，利用这一系统筛选到了许多重要的信号分子。鉴于双杂交技术在信号转导领域中的重要作用，我们开始探索建立这一方法。
G蛋白和CaM是植物细胞信号转导中的两个重要的信号组分，它们参与细胞的多种反应，具有重要的生理功能。本文利用酵母双杂交系统分别筛选了与这两种蛋白相互作用的蛋白质，以进一步研究G蛋白和CaM信号转导途径中的其它上下游组分。本工作为我室酵母双杂交方法的建立打下了一个良好的基础。
首先以G蛋白α亚基为诱饵构建了诱饵蛋白表达载体。通过PCR扩增得到GPA1基因并将其克隆到双杂交DNA结合域载体pGBKT7中，得到的重组质粒命名为pGBKT7-Gα，β—半乳糖苷酶活性鉴定表明Gα不具有自激活特性，将其转化到酵母菌pJ69-4A中，再以此为受体菌转化拟南芥绿色营养组织cDNA文库质粒。利用营养缺陷型和β—半乳糖苷酶活性筛选到4个阳性克隆，测序结果表明它们具有相同的序列。到Genbank进行序列比对，结果表明它们编码拟南芥叶绿体碳酸酐酶(CA)基因，编码区含有部分CA序列，从N端第86位氨基酸至C末端，共251个氨基酸。通过RT-PCR克隆了CA编码区全长cDNA，但是在双杂交系统检测全长CA与G蛋白的相互作用时，结果为阴性。之后将成熟CA和文库中筛到的CA编码部分的基因分别亚克隆至双杂交激活域载体pGADT7，进行双杂交检测它们与G蛋白的相互作用，结果仍为阴性。
其次，以拟南芥2号亚型钙调素(ACaM2)为诱饵蛋白对双杂交文库进行了筛选。构建了诱饵蛋白表达载体pGBKT7-ACaM2。鉴定ACaM2不具有自激活后将其转化到酵母菌pJ69-4A中，以此为受体菌转化拟南芥绿色营养组织cDNA文库质粒。利用营养缺陷型和β—半乳糖苷酶活性筛选到2个阳性克隆。测序及序列比对结果表明二者序列相同，为KED样蛋白的部分编码序列，编码部分从N端第240位氨
宋林夜:利用酵母双杂交系统筛选与G蛋白及CaM相互作用的新型蛋白
基酸至C末端，共207个氨基酸。利用体外转录翻译系统和免疫共沉淀验证了这两
种蛋白在体外的相互作用，结果表明KED样蛋白能够在体外与ACaMZ发生相互作
用，并且这种作用是c扩+依赖型的。进一步通过RT.pcR克隆了KED样蛋白编码区
全长cDNA，通过双杂交验证了全长KED样蛋白与ACaMZ的相互作用，结果为阳
性。对这一蛋白的CaM结合域进行了预测，表明KED样蛋白的CaM结合域在其C
【关键词】：
【学位授予单位】：河北师范大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2003【分类号】：Q946【目录】：
ABSTRACT10-12
第一部分 文献综述12-34
第一章 酵母双杂交技术的进展及应用12-26
1 酵母双杂交的原理12-13
2 酵母双杂交技术的进展13-21
2.1 酵母单杂交13-14
2.2 酵母三杂交14-15
2.3 反式双杂交15-16
2.4 分裂杂交系统16-17
2.5 Sos拯救系统17
2.6 分裂泛素系统17-18
2.7 建立在RNA聚合酶Ⅲ基础上的双杂交18-19
2.8 双诱饵系统19-20
2.9 双杂交酶(two-hybridzyme)20-21
3 其它宿主系统的双杂交21-23
3.1 细菌双杂交21-22
3.2 哺乳动物双杂交22-23
4 酵母双杂交在蛋白质组学中的应用23-24
5 酵母双杂交在植物中的应用24-25
6 展望25-26
第二章 植物钙调素结合蛋白研究进展26-34
1 植物CaM概述26-27
2 钙调素结合蛋白的结构27-28
2.1 Ca~(2+)非依赖型的CaM结合结构27-28
2.2 Ca~(2+)依赖型的CaM结合结构28
3 植物钙调素结合蛋白的功能28-32
3.1 调节代谢29
3.2 参与热激反应29-30
3.3 参与缺氧和盐的反应30
3.4 对重金属的反应30-31
3.5 参与病原抗性反应31
3.6 参与激素信号转导31-32
3.7 未知功能32
4 结论与展望32-34
第二部分 研究论文34-80
第三章 利用酵母双杂交系统筛选与G蛋白相互作用的蛋白36-61
1 双杂交文库的筛选36-50
1.1 材料36-39
1.2 方法39-44
1.3 结果44-50
1.3.1 诱饵蛋白表达载体的构建及序列测定44-46
1.3.2 诱饵蛋白Gα的自激活特性鉴定46
1.3.3 拟南芥cDNA文库的筛选46-47
1.3.4 阳性克隆相互作用特异性的鉴定47-48
1.3.5 阳性克隆中cDNA片段的序列测定48-49
1.3.6 序列比对49-50
1.4 小结50
2 CA编码区全长cDNA的克隆，成熟CA基因的克隆及酵母双杂交检测50-57
2.1 材料50-51
2.2 方法51-52
2.3 结果52-56
2.3.1 CA编码区全长cDNA的克隆52-53
2.3.2 酵母双杂交检测CA全长与G蛋白的相互作用53-54
2.3.3 成熟CA基因亚克隆至pGADT754
2.3.4 酵母双杂交检测成熟CA与G蛋白的相互作用54-55
2.3.5 含有转运肽C端28个氨基酸的成熟CA基因(28CAm)亚克隆至pGADT755
2.3.6 酵母双杂交检测含有转运肽C端28个氨基酸的成熟CA(28CAm)与G蛋白的相互作用55-56
2.4 小结56-57
3 讨论57-61
3.1 酵母双杂交的基本原理及优缺点57-58
3.2 碳酸酐酶与G蛋白的相互作用58-59
3.3 酵母双杂交方法的某些体会59-61
第四章 利用酵母双杂交系统筛选与CaM相互作用的蛋白61-80
1 双杂交文库的筛选61-68
1.1 材料61
1.2 方法61
1.3 结果61-67
1.3.1 诱饵蛋白表达载体的构建及序列测定61-63
1.3.2 诱饵蛋白ACaM2的自激活特性鉴定63
1.3.3 拟南芥cDNA文库的筛选63-64
1.3.4 阳性克隆相互作用特异性的鉴定64-66
1.3.5 阳性克隆中cDNA片段的序列测定66-67
1.3.6 序列比对67
1.4 小结67-68
2 免疫共沉淀鉴定ACaM2与KED样蛋白的结合68-72
2.1 材料68-69
2.2 方法69-70
2.3 结果70-71
2.3.1 用于免疫共沉淀的重组质粒pGADT7-KED3的构建70-71
2.3.2 免疫共沉淀71
2.4 小结71-72
3 KED样蛋白编码区全长cDNA的克隆，酵母双杂交检测及序列分析72-77
3.1 材料72
3.2 方法72
3.3 结果72-76
3.3.1 拟南芥KED样蛋白编码区全长cDNA的克隆72-74
3.3.2 KED样蛋白与ACaM2相互作用的酵母双杂交检测74-75
3.3.3 KED样蛋白的CaM结合域的序列分析75-76
3.4 小结76-77
4 讨论77-80
4.1 CaM与KED的相互作用77-78
4.2 采用酵母双杂交系统寻找胞外CaM受体的探讨78-80
参考文献81-94
附录：94-101
第五章 胞外CaM对rbcS3A基因表达调控的部分研究94-101
1 材料94-95
2 方法95-96
3 结果96-100
3.1 Actin杂交探针的获得96-98
3.2 Actin Northern blot98-99
3.3 CaM抗体+红光处理对rbcS3A表达的影响99-100
4 小结100-101
致谢101-102
个人简历102
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