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05:15:48&&&来源：&&&评论：&&
[western blotting 显色方法的选择？请高手们帮帮忙！万分谢谢] 目前我看到的带有标记的二抗，主要标记的是AP和HRP，而HRP主要采用DAB法显色。我想请问一下选用哪种二抗比较好，是标记AP的还是标记HRP的？HRP采用DAB法显色的效果怎么样？用曝光的方法显色的效果怎么样？以前做过用HRP标记过的探针，作反northern杂交，效果不好，所以这次做WESTERN BLOTTING对选择曝光的方法显色有点担心,想看看大家做显色时采用什么方法？有什么好的方法没有 关键词:[二抗 试剂 探针 试剂盒]…
目前我看到的带有标记的二抗，主要标记的是AP和HRP，而HRP主要采用DAB法显色。我想请问一下选用哪种二抗比较好，是标记AP的还是标记HRP的？HRP采用DAB法显色的效果怎么样？用曝光的方法显色的效果怎么样？以前做过用HRP标记过的探针，作反northern杂交，效果不好，所以这次做WESTERN BLOTTING对选择曝光的方法显色有点担心,想看看大家做显色时采用什么方法？有什么好的方法没有？做WESTERN 显色用哪个显色盒效果又好，有比较经济的？ 我看到有很多人是自己配制的显色液等，自制的显色试剂，显色效果怎么样？ 请大家帮帮我这个新手，非常感谢！
我做过DAB染色的，但是显色效果不好，不是很特异，很多蛋白条带都被染色了。我同学说ECL显色的效果比较好，我正想试试
1,HRP用ECL曝光得效果是很好得，大部分朋友都在用这种方法做，完全不必要担心奥，而且结果假阳性得可能也小（DAB则容易出现），其结果国外杂志也比较认同2碧云天新推出得新的ECL PLUS 不错，价格在200多一些，当然如果想用好的话，可以购买PIERCE的，其中最灵敏的大概1000元左右20ML.效果是非常不错的3 显影液大都是从照相器材店购买，两元左右一包，配成250ML.效果很好：）祝试验顺利
我们采用HRP标记的二抗，显色采用Pierce的SuperSignal& West Pico化学发光底物，荧光强度高，发光时间长，效果很不错。 目前国外期刊用的以HRP、化学（ECL、SuperSignal）居多。DAB显色很少见。网上搜到的一些基础知识如下： 酶促反应比安全且快速，已经成为Western Blot的主流检测方法。酶促反应可以搭配不同的底物从而实现不同的显色方法：化学发光Chemiluminescent和底物显色Colormetirc/Chromogen，前者灵敏度很高——随着各大厂家努力开发研制灵敏度更高的发光底物，化学发光法的灵敏度已经达到pg级别，甚至还有 Femto级别的，灵敏度超过了；而后者由于直接显色而操作简便且成本低。最为大家熟悉当数辣根过氧化物酶HRP（Horseradish Peroxidase，属于过氧化物酶POD类）和碱性AP（Alkaline Phosphatase）：一、HRP： HRP 辣根过氧化酶是最常见的酶促发光或显色的交联酶，由于HRP比活高、特异性更强、分子量小（40kD）、稳定和作用底物范围广的优点而得到广泛使用。HRP的底物种类有不少，主要可以分为化学发光底物和生色底物2大类: 1. 化学发光底物： 化学发光底物主要考虑的是：发光信号强弱——发光信号当然越强越好，强发光信号持续的时间——也是越长越好，还有就是背景低灵敏度高。 Luminol是经典的HRP化学发光底物。GE Healthcare（原安玛西亚）的ECL堪称是经典。 除了拥有王牌产品ECL的GE公司，化学发光底物方面不得不提到Pierce公司。Pierce拥有世界上最优秀的HRP化学发光底物生产技术——世界上许多知名的化学发光底物试剂盒厂商都采用PIERCE提供的化学发光底物作为生产原料。其中最耀眼的璀璨之星是SuperSignal系列。SuperSignal灵敏度高（有10{-12}g级，10{-14}g级，10{-15}g 级选择），发光持久（6-24小时），可反复曝光，稳定性好（室温贮藏6个月，4℃至少是12个月），节约抗体（由于灵敏度高，一抗二抗稀释倍数是同类产品的10倍以上，这对于宝贵一抗来说十分重要）。 SuperSignal& West Pico化学发光底物 SuperSignal& West Femto超灵敏型底物 SuperSignal& West Femto增强型底物
主要优点 与ECL™ 系统相比减半的价格、双倍的信号 适用于HRP检测的最灵敏的化学发光底物 延长的信号持续时间使这种底物用于今天的成像设备最为理想。
2.生色底物： HRP的生色底物显色有DAB，4-CN ，CN/DAB，AEC和TMB等（而得到可溶性产物的底物如OPD，ABTS等则适用于ELISA）中，与化学发光法中的酶促基团发光不同，底物显色主要是利用底物在有HRP和过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化积累这一过程检测WB的结果。 最熟悉的底物应该是3"3"二氨基联苯胺DAB，DAB可以和HRP作用形成褐色不溶性产物，灵敏度高，特异性好，缺点就是需要现配现用，显色后光照数小时会褪色，不能永久保存，需要拍照记录，而且有毒。二、AP： Western Blot检测系统中常用交联酶两大家族中的另外一类就是AP——碱性。碱性磷酸酶很早就被用于检测系统——包括固定化抗原（WB）检测和核酸检测。但是做过AP实验的经常会遇到膜上显色背景偏高的问题，所以就WesternBlot本身来说偏爱HRP的要比AP多——分子克隆III解释说由于在我们常用的封闭剂：脱脂奶粉和牛白蛋白BSA中富含AP，这样当然显色背景会高。所以分子克隆III推荐的AP适用封闭剂是6%的酪蛋白+1%聚乙烯吡咯烷酮+10mmol
65度加热一小时确保AP失活后再用于封闭。一些研究的样本自身也含有较高水平的碱性磷酸酶，虽然实验上很容易实现抑制内源AP影响，但实际上容易被忽略。AP显色底物生成的产物主要是蓝紫色，成像性好容易拍照。早些年前，AP检测的灵敏度比HRP高，但是背景也偏高，整个显色过程更有“技术性”，有许多个人技巧在里面，让人取舍两难。如今由于HRP的化学发光底物已经不断改进而使得灵敏度不断提高，化学发光显色上HRP和AP不相上下，但是生色反应来说，AP显色的灵敏度还是比一般的HRP显色底物要高。 AP作为一种经典常用的显色交联酶，自有其优点，比如AP的底物显然更稳定，不像HRP那样需要新鲜配制的H2O2一类的不稳定成分，作为试剂盒可以保存时间更长，特别是习惯用显色方法检测WB结果的。就像HRP可以用于化学发光和底物显色一样，AP也有这两种常用的检测方法的不同底物。AP显色的灵敏度就已经可以达到低皮克级，前提是封闭要做得好。常用的是BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3’-Indolyphosphate p-Toluidine Salt) ，NBT (Nitro-Blue Tetrazolium Chloride)和INT。 几乎出显色剂的厂家都会生产到这几种底物，比如Roche的BCIP和INT/BCIP ，Pierce的BCIP/NBT，其中以BCIP/NBT灵敏度最高，显色也比较锐利，成像性比较好，因此也就最常用到。预配的即用型显色底物不存在颗粒性底物，较少产生斑点背景。NEB和Invitrogen也有完整的检测试剂盒。
最常用得是HRP+GE healthcare得ECL暴光显色试剂
非常感谢大家的回帖，给了我很多指点，特别要谢谢akanggg的回帖，让我对显色有了更进一步的了解。我还有一个疑问，就是BCIP/NBT能够让HRP显色吗？现在一般是买显色试剂盒，还是自己配制试剂阿？完全的显色试剂盒，是不是就是指除了一抗，以外的一切杂交所需的试剂阿？好像有很多人只买显色的底物，其他的杂交液，封闭液都是自己配制的，这样自制的试剂好用吗？
显色试剂盒只含有显色试剂，别的都是自己配制，我用的都是，只要你试剂配制过程没有问题．效果都很好的．
我一般用的都是GE healthcare的ECL PLUS.很不错.偶尔也用用ECL.
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