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总悬浮颗粒物，氟化物、pH，化学需氧量、总汞，总镉，总砷，总铅，总镉，总铜，六价铬，氰化物，石油类，挥发酚，粪大肠菌群数
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检测分类&其他
样品名称&无公害食品草莓产地环境条件
检测项目&总悬浮颗粒物，氟化物、pH，化学需氧量、总汞，总镉，总砷，总铅，总镉，总铜，六价铬，氰化物，石油类，挥发酚，粪大肠菌群数 检测标准&无公害食品
草莓产地环境条件
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美国分析化学中国实验室&
美国分析化学实验室集团（AACL）总部位于美国伊利诺伊州Champaign市，创建于一九九四，是一个全球领先并经美国FDA严格审核认证的权威的第三方分析测试机构。于2005年，在中国建立北京测试中心。
AACL在业界拥有十六年丰富的产品质量标准建立、分析方法开发、验证及测试服务经验。于动物/植物提取物、医药、保健品、食品安全、化妆品及环保污染等行业领域独具专长。AACL科学公正的质量分析方法及检测报告完全获得美国FDA的认可，具有国际权威性，已成为客户产品顺利进入欧、美、日等国际高端市场的良好品质保证。
作为一个始终以客户为先、完全负责任的独立分析检测机构，AACL凭借丰富的分析测试服务经验、强大的研发能力和严格的质量管理体系在业界赢得了良好声誉。截至2009年11月，AACL公司的全球客户已多达六百余家，其中包括多家全球排名五百强的跨国食品、药品行业巨头，如Pepsico，ADM，ConAgra，Danisco，Merck，Nuskin和Altria等，并成为多家国际合作伙伴唯一的第三方分析检测/品质认证服务机构。
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了解大肠杆菌在食品卫生检验中的意义。对水中微生物卫生指标为例进行检验，学习并掌握微生物 M.P.N 法。 二、原理概述
大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在 37 ℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。
大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。
大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。
大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。 三、实验器材
1 、材料：待检验水 无菌生理盐水
2 、培养基：单料乳糖胆盐发酵管 双料乳糖胆盐发酵管 伊红美蓝琼脂 革兰氏染色液
3 、仪器：恒温箱 天平 培养皿 载玻片等 四、操作步骤和内容
1. 乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。 36 ± 1 ℃ 培养 24 ± 2h ，观察是否产气。
2. 分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上， 36 ± 1 ℃ 培养 18-24h ，观察菌落形态。
3. 证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管 36 ± 1 ℃ 培养 24 ± 2h ，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌即可报告为大肠菌群阳性。
4. 报告：根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查 MPN 表，报告每 100ml （ g ）大肠菌群的 MPN 值。
大肠菌群最可能数（ MPN ）检索表
95% 可信限
0.1mL(g)x3
0.01mL(g)x3
注 1 ：本表采用 3 个稀释度 [1mL(g) 、 0.1mL(g) 和 0.01mL(g)], 每稀释度 3 管。
注 2 ：表内所列检样量如改用 10mL(g) 、 1mL(g) 和 0.1mL(g) 时，表内数字相应降低 10 倍；如改用 0.1mL(g) 、 0.01mL(g) 和 0.001mL(g) 时，则表内数字应相应增加 10 倍，其余可类推。 五、说明
（ 1 ） MPN 检索表：
MPN 为最大可能数 (Most Probable Number) 的简称。这种方法，对样品进行连续系列进行稀释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。
MPN 检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加 10 倍。注意国家标准和行业标准中所附 MPN 表所用稀释度是不同的，而且结果报告单位也不相同。
（ 2 ）初发酵和证实试验：
无论是国家标准的三步法还是行业标准的两步法，都利用了乳糖发酵管进行了两次发酵试验，培养基的配制略有不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在 37 ℃分解乳糖产酸产气”。
初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，经过证实试验后，有时可能成为阴性。有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。
（ 3 ）产气量与倒管：
在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。实验表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。
（ 4 ）挑选菌落：
国家标准中，需要对初发酵阳性培养物接种伊红美蓝平板分离，对典型和可疑菌落进行观察和证实试验。由于大肠菌群是一群细菌的总称，在平板大肠菌群菌落的色泽、形态等方面较大肠菌更为复杂和多样，而且与大肠菌群的检出率密切相关。国家标准方法规定伊红美蓝平板为分离培养基，在该平板上，大肠菌群菌落呈黑紫色有光泽或无光泽时，检出率最高；红色、粉红色菌落检出率较低。
另外，挑取菌落数与大肠菌群的检出率有密切关系，只挑取一个菌落，由于机率问题，尤其当菌落不典型时，很难避免假阴性的出现。所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如无典型菌落则应多挑几个，以免出现假阴性。
（ 5 ）抑菌剂：
大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。 六、结果
水中大肠菌种 M.P.N 值
大肠菌数／ 100ml
& 七、思考题
什么是大肠菌群，测检食品中大肠菌群的意义是什么？常用什么培养基？该培养基中各种成分的主要作用是什么？这是一类什么性质的培养基？您所在位置： &
&nbsp&&nbsp&nbsp&&nbsp
食品或水中大肠菌群的检测.ppt18页
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食品中细菌总数及
大肠菌群值的检测一、目的要求
1.了解食品卫生微生物学的重要性及其原理
2.学会食品中细菌菌落总数的测定方法和平
板活菌计数法
3.学会食品中大肠菌群数的测定方法二、基本原理
1、食品卫生微生物学指标包括细菌菌落总数、大肠
菌群数和致病菌数量。前两者在日常检测中是必检项
2、细菌菌落总数是指水中或食品检样经处理后,在
一定条件培养后,所得1 g或1 mL检样中所含细菌菌
落的总数,其主要作为判定食品被污染程度的标志。
3、大肠菌群是肠道最普遍存在和数量最多的一群细
菌、常将其作为人畜粪便污染的标志。水和食品中大
肠菌群数是以每100 mL(g)检样中大肠菌群最可能
数(MPN)表示的。菌落总数简介菌落总数是指在被检样品的单位重量(g)、容积
(ml)或表面积(cm2)内,所含能于某种固体培
养基上,在一定条件下培养后所生成的菌落的总
数。菌 落 总 数 测 定?? 卫 生 学 意 义判定食品被细菌污染的
程度及卫生质量。 菌 落 总 数 测 定 流 程 倾 注 平 板 法检样1mL+9ml稀释液(磷酸盐缓冲液) 适当十倍稀释样品
选择2~3个连续适宜稀释度
各取1mL分别加入灭菌平皿内
(每个稀释度做两个平行)每皿内加入适量平板计数琼脂(PCA) 35 ℃ ,48 ± 2h
菌落计数 菌 落 总 数 测 定 几 点 说 明由于检样中采用30/35℃有氧条件下培养,一些特殊营
养要求的细菌、厌氧菌、微需氧菌、以及非嗜中温细
菌,均难以反映出来。鉴于食品检样中的细菌细胞是以单个、成双、链状、
葡萄状或成堆的形式存在,因而在平板上出现的菌落
可以来源于细胞块,也可以来源于单个细胞,因而平
板上所得菌落的数字不应报告活菌数,而应以单位重
量、容积或表面积内的菌落数或菌落形成单位
(colony forming units,CFU
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水中细菌总数和大肠菌群的检测
（一)实验目的
&&& (1)了解和学习水中细菌总数和大肠菌群的测定原理和测定意义。
&&& (2)学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法。
&&& (3)学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。
（二)实验原理
&&& 水是微生物广泛分布的天然环境。各种天然水中常含有一定数量的微生物。水中微生物的主要来源有：水中的水生性微生物(如光合藻类)、来自土壤径流、降雨的外来菌群和来自下水道的污染物和人畜的排泄物等。水中的病原菌主要来源于人和动物的传染性排泄物。
&&& 水的微生物学的检验，特别是肠道细菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。国家饮用水标准规定，饮用水中大肠菌群数每升中不超过3个，细菌总数每mL不超过100个。
&&& 所谓细菌总数是指1mL或1g检样中所含细菌菌落的总数，所用的方法是稀释平板计数法，由于计算的是平板上形成的菌落(colony-forming unit，cfu)数，故其单位应是cfu/g(mL)。它反映的是检样中活菌的数量。
&&& 所谓大肠菌群，是指在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称，主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。
&&& 水的大肠菌群数是指100mL水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数(MPN)表示。在正常情况下，肠道中主要有大肠菌群、粪链球菌和厌氧芽胞杆菌等多种细菌。这些细菌都可随人畜排泄物进入水源，由于大肠菌群在肠道内数量最多，所以，水源中大肠菌群的数量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标。目前，国际上已公认大肠菌群的存在是粪便污染的指标。因而对饮用水必须进行大肠菌群的检查。
&&水中大肠菌群的检验方法，常用多管发酵法和滤膜法。多管发酵法可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样。
(三)实验器材
(1) 菌落总数的测定：
1)培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌生理盐水。
2)器材：灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等。
(2)大肠菌群的测定；
&&& 1)培养基：
&&& ①乳糖胆盐蛋白胨培养基：
&&& 蛋白胨20g，猪胆盐(或牛、羊胆盐)5g，乳糖10g，0.04%溴甲酚紫水溶液25mL，水1000mL，pH7.4。
&&& 制法：将蛋白胨、胆盐从乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装，每瓶50mL或每管5mL，，并倒置放入一个杜氏小管，l15℃灭菌15min。
&&& 双倍或三倍乳糖胆盐蛋白胨培养基：除水以外，其余成分加倍或取三倍用量。
&&& ②伊红美蓝琼脂培养基：
&&& 蛋白胨10g，乳糖10g，
K2HP04 2g， 2％伊红水溶液20Ml，0.65％美蓝水溶液lOmL，琼脂17g，水1000mL，pH7.1。
&&& 制法：将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶于水中，校正pH后分装．121℃灭菌15min备用。临用时加入乳糖并熔化琼脂，冷至50-55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。
&&& ③乳糖发酵管：
&&& 除不加胆盐外．其余同乳糖胆盐蛋白胨培养基。
&&& 2)器材：灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等。
（四）实验方法
(1)水样的采集：
&&1)自来水：先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，再开放水龙头使水流5min，以灭菌三角瓶接取水样以备分析。
&&& 2)池水、河水、湖水等地面水源水：在距岸边5m处，取距水面10-15cm的深层水样，先将灭菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。如果不能在2h内检测的，需放入冰箱中保存。
&&& (2)细菌总数的测定：
&&& 1)水样稀释及培养：
&&& ①按无菌操作法，将水样作10倍系列稀释：
&&& ⑦根据对水样污染情况的估计，选择2-3个适宜稀释度(饮用水如自来水、深井水等，一般选择1、1:10两种浓度；水源水如河水等，比较清洁的可选择1:10、1:100、1:1000三种稀释度；污染水—被选择1:100、1:1000、1:10000三种稀释度)，吸取1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作3个重复。
&&& ③将熔化后保温度45℃的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平皿，每皿约15mL，并趁热转动平皿混合均匀。
&&& ④待琼脂凝固后，将平皿倒置于37℃培养箱内培养24±1h后取出，计算平皿内菌落数目，乘以稀释倍数，即得1mL水样中所含的细菌菌落总数。
&&& 2)计算方法：
&&& 作平板计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数。
3)计数的报告：
①平板菌落数的选择：
&&& 选取菌落数在30-300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个重复时，应选取两个平板的平均数。如果一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板计数作为该稀释度的菌数。若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，可计算半个平板后乘2以代表整个平板的菌落数。
&&& ②稀释度的选择：
a. 应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度，乘以该稀释倍数报告之(表1例1)。
&&& b．若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30-300之间，则视二者之比如何来决定。若其比值小于2，应报告其平均数；若比值大于2，则报告其中较小的数字(l例2、例3)。
c．若所有稀释度的平均菌落均大于300，则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(l例4)。
d．若所有稀释度的平均菌落数均小于30、则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(1例5)。
e. 若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之（表1例6)。
&&& f. 若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，则以最接近30或300的平均菌落数乘以该稀释倍数报告之(表l例7)。
&&& ③细菌总数的报告：
&&& 细菌的菌落数在l00以内时，按其实有数报告；大于100时，用二位有效数字，在二位有效数字后面的数字，以四舍五入方法修约。为了缩短数字后面的0的个数，可用10的指数来表示，如表1“报告方式”一栏所示。
(3)大肠菌群的测定(多管发酵法)：
表 1 稀释度的选择及细菌数报告方式
稀释度及菌落数
两稀释度之比
菌落总数/（cfu/g或cfu/mL）
报告方式（菌落总数）/（cfu/mL或cfu/g）
16000或1.6×104
38000或3.8×104
27000或2.7×104
310000或3.1×105
31000或3.1×104
<span lang=EN-US style='color:#)生活饮用水或食品生产用水的检验：&&& ①初步发酵试验：&&& 在2个各装有50mL的3倍浓缩乳糖胆盐蛋白胨培养液(可称为三倍乳糖胆盐)的三角瓶中(内有倒置杜氏小管)，以无菌操作各加水样100mL。在10支装有5mL的三倍乳糖胆盐的发酵试管中(内有倒置小管)，以无菌操作各加入水样10mL。如果饮用水的大肠菌群数变异不大，也可以接种3份100mL水样。摇匀后，37℃培养24h。&&& ②平板分离：&&& 经24h培养后，将产酸产气及只产酸的发酵管(瓶)，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板(EMB培养基)上，37℃培养18—24h。大肠菌群在EMB平板上，菌落呈紫黑色，具有或略带有或不带有金属光泽，或者呈淡紫红色，仅中心颜色较深；挑取符合上述特征的菌落进行涂片，革兰氏染色，镜检。& ③复发酵试验：& 将革兰氏阴性无芽胞杆菌的菌落的剩余部分接于单倍乳糖发酵管中，为防止遗漏，每管可接种来自同一初发酵管的平板上同类型菌落1—3个，37℃培养24h，如果产酸又产气者，即证实有大肠菌群存在。&&& ④报告：&&& 根据证实有大肠菌群存在的复发酵管的阳性管数，查表107-2（或表107-3），报告每升水样中的大肠菌群数(MPN)。&&& 2)水源水的检验：&&& 用于检验的水样量，应根据预计水源水的污染程度选用下列各量。&&& ①严重污染水：1，0．1，0．01．0．00lmL各1份。&&& ②中度污染水：10．1，0．1，0．01mL各1份。&&& ③轻度污染水：100，10，1，0．1mL各l份。④大肠菌群变异不大的水源水：10mLl0份。&表2 大肠菌群检索表（饮用水）
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每升水样中大肠菌群数
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接种水样总量300mL（100 mL2份，10 mL10份）
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&表3 大肠菌群数变异不大的饮用水
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接种水样总量300mL（3份100 mL）
每升水样中大肠菌群数
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&表4 大肠菌群检索表（严重污染水）
接种水样量/mL
每升水样中大肠菌群数
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接种水样总量为1.111（1，0.1，0.01，0.001mL各一份）
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&表5大肠菌群检索表（中度污染水）
接种水样量/mL
每升水样中大肠菌群数
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接种水样总量为11.11（10，1，0.1，0.01 mL各一份）
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&表6大肠菌群检索表（轻度污染水）
接种水样量/mL
每升水样中大肠菌群数
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接种水样总量为111.1（100，10，1，0.1mL各一份）
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&表7 大肠菌群变异不大的水源水
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每升水样中大肠菌群数
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接种水样总量100mL(10mL10份)
&操作步骤同生活用水或食品生产用水的检验。同时应注意，接种量1mL及1mL以内用单倍乳糖胆盐发酵管；接种量在1mL以上者，应保证接种后发酵管(瓶)中的总液体量为单倍培养液量。然后根据证实有大肠菌群存在的阳性管(瓶)数，查表107-4、表l07-5、表107-6或表107-7，报告每升水样中的大肠菌群数(MPN)。&&& 附：滤膜法&&& 滤膜法所使用的滤膜是一种微孔滤膜。将水样注入已灭菌的放有滤膜的滤器中，经过抽滤，细菌即被均匀地截留在膜上，然后将滤膜贴于大肠菌群选择性培养基上进行培养。再鉴定滤膜上生长的大肠菌群的菌落，计算出每升水样中含有的大肠菌群数(MPN)。&&& (1)准备工作：&& &&&&&1)滤膜灭菌：将3号滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中蒸煮灭菌3次，每次15min。前两次煮沸后需换无菌水洗涤2-3次，以除去残留溶剂。&&& 2)滤器灭菌：准备容量为500mL的滤器，用点燃的酒精棉球火焰灭菌，也可用121℃高压灭菌20min。&&& &&&&3)培养：<span
lang=EN-US style='color:#）培养：将品红亚硫酸钠培养基放入37℃培养箱内预温30-60min。&&& (2)过滤水样： &&&1)用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将祖糙面向上贴放于已灭菌的滤床上，轻轻地固定好滤器漏斗。水样摇匀后，取333mL注入滤器中，加盖，打开滤器阀门，在—50kPa压力下进行抽滤。&&& 2)水样滤完后再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用无菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在品红亚硫酸钠培养基上，滤膜截留细菌面向上与培养基完全紧贴，两者间不得留有间隙或气泡。若有气泡需用镊子轻轻压实，倒放在37℃培养箱内培养16-18h。&&& (3)结果判定：&&& 1)挑选符合下列特征的菌落进行革兰氏染色，镜检。&&& ①紫红色，具有金属光泽的菌落。
②深红色，不带或略带金属光泽的菌落。
&&& ③淡红色，中心颜色较深的菌落。
&&& 2)凡是革兰氏阴性无芽胞杆菌，需再接种于乳糖蛋白胨半固体培养基，37℃培养6-8h，产气者，则判定为大肠菌群阳性。
&&& 3)1L水样中大肠菌群数等于滤膜法生长的大肠菌群菌落数乘以3。}