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急求！大容量载体与片段连接问题
现手上有一质粒，大小为10kb，红霉素抗性。没有全序列，只有其编码的一个基因的序列，大小约为1.5kb。测序发现，该基因的一个碱基发生了点突变，导致编码蛋白的活性很低。为了解决这个问题，我通过HindIII和KpnI两个酶将这段序列切下来，连接到puc 19这个载体上。后通过点突变试剂盒完成了该碱基的突变。后再通过上述两个酶把该基因的片段连回上述大质粒，连接转化了有2个月，长的菌都是假阳性（大肠杆菌对红霉素有一定的耐受性）。酶切后的载体经纯化后浓度为30ng/微升，1.5kb的片段纯化后浓度为40ng/微升，连接体系10微升，20微升都试过了，各种比例（载体：片段=1:3-6）都试过了，采用电转方式，感受态是dh5a，都没有阳性克隆长出。咨询了一些人，有些人认为大载体连接，我这个浓度太低了，要切胶纯化后达到几百ng/微升才行；有些人建议连接体系放大些，比如50微升，连接后再用乙醇浓缩等等。这些都准备试一下，还请大家针对我这个问题，提提建议，:hand:，谢谢！
看了你的情况有以下几点看法
1.你转化后的假阳性是含有空载质粒的转化子还是菌里面啥质粒都没有就能长出来。如果是前者那很有可能你对载体的酶切不完全，那在酶切上下工夫，比如延长切割时间或者分步酶切。如果是后者的话，那你得做个红霉素浓度梯度的实验，设置不同抗生素浓度的平板，一批平板涂含质粒的菌，一批涂不含质粒的菌，最好的结果是一定浓度的抗生素能完全抑制野生菌而又不影响带质粒菌转化子的出现。抗生素的筛选效果很重要，如果抗生素效果不行那你后期的转化后筛选会非常困难。
2.你载体明显不够，一般连接载体添加量得有0.02pmol，大约相当于4kb的质粒50ng，基因大于等于0.06pmol，大约相当于1kb的基因37.5ng以上，你的质粒那么大那单位质量的摩尔数肯定小，你的质粒和基因的浓度都不高，整个体系中你还要顾及基因和载体的比例因此你的载体肯定没有加够，抗生素筛选效果再不好的话，自然很多的假阳性
3.你那个基因和载体的比例是质量比吗？如果是质量比的话那你的基因和载体的摩尔比远高于10:1，你说的那个1:3——1:6是指的摩尔比，单纯的质量比没有任何意义。一般来说基因和载体的摩尔比在3:1到10:1之间，过高的比例不利于正确的连接。
4.因为你的载体还是很大的，酶连可能确实不好连，但是handIII的粘性末端连接效率很高，因此酶连最好分两步走，首先用小体系（10ul）16度过夜酶连或者酶连20h，之后加水稀释补加T4酶和buffer到20ul—50ul进行二次酶连，酶连完不需要浓缩取适当体积进行转化即可。 : Originally posted by luwei13566 at
看了你的情况有以下几点看法
1.你转化后的假阳性是含有空载质粒的转化子还是菌里面啥质粒都没有就能长出来。如果是前者那很有可能你对载体的酶切不完全，那在酶切上下工夫，比如延长切割时间或者分步酶切。如果是后 ... 1.菌里没有质粒，红霉素我用的浓度时250微克/mL，我看文献一般都是这个浓度，长出来的菌也都是不含质粒的，不过要培养箱放置个2-3天才能长出，如果是正常红霉素抗性的，第二天就能长出。
2.我说的比例是摩尔比，显然我的载体浓度低了，我要多提些质粒，多酶切纯化一些。
3.如果按照你的第四点的说法，电转时离子浓度会不会过高，影响电转？ : Originally posted by chenchenand at
1.菌里没有质粒，红霉素我用的浓度时250微克/mL，我看文献一般都是这个浓度，长出来的菌也都是不含质粒的，不过要培养箱放置个2-3天才能长出，如果是正常红霉素抗性的，第二天就能长出。
2.我说的比例是摩尔比，显 ... 如果你用电转化可能会有点影响，电转化之前可能需要乙醇沉淀下DNA，不过如果你的DNA不多的话用乙醇沉淀损失非常大，很容易看不到沉淀，可以多连接几管然后转到一管进行浓缩。 载体：0.03pmol=19.8*10000/（1000*30）ul
片段：0.15pmol=19.8*5**40)ul
这个比例是1:5.
如果实在不行& &可以试一下&&我这样做基本都会做出来&&而且电转的话&&阳性率也高&& 查看话题
目的基因与载体连接问题
我PCR的目的基因4600bp，想直接去连接载体pPIC3.5k（大概9000bp），按照正常的连接过程一直都连接不上，各位有谁做过类似的实验吗，求帮助啊！！！！！！
载体太大了，换个小载体试试。克隆成功以后再转到这个大载体中 可以找个公司给你试试，但是也不能保证一定成功。 PCR片段有点大，你试着把链接体系中的目的片段量降低，降到跟载体差不多或者稍微比载体量多一些，延长链接时间；另外要确保载体和片段酶切充分，并且酶切位点正确，不要有星活性出现； 目的基因太大，可将质粒缩小成backbone质粒，就是将质粒上一些没用的序列去掉，如果目的基因太大，可以分步进行。 按正常程序连的话，应该也是没有问题的，不知道你一直都连接不上，走的是什么过程 两个太大的确不太好连，我之前做过4K+5K
建议质粒进行两次单酶切，时间可以长一点
还有就是坚持，太大了没办法 不知道楼主的问题解决了没有，这个我经验比较多，楼主可以参考下
无论大小片段连接，最重要的就是片段浓度和纯度。
如果PCR片段的杂带不是太多，建议不要切胶，直接将pcr产物过纯化kit，酶切，再直接连接；载体也是一样，如果低拷贝的质粒浓度不高，可以过量酶切之后直接纯化，连接。
PCR片段可以适当加的比例高一些。
祝你好运。当前位置：&&iPhone6又曝新问题：手机无法与车载蓝牙连接
iPhone6又曝新问题：手机无法与车载蓝牙连接
|作者:玛莎|来源:265G
又曝新问题：手机无法与车载蓝牙连接 继被坐弯，iOS8应用崩溃增多后，苹果官网论坛目前再次出现大量投诉。有不少用户抱怨，自己的手机无法与车载蓝牙连接。还有人建立了专门讨论这个问题的论坛，更多人则在Twitter上表达自己的不满。用户们表示，蓝牙连接要么功能不全，要么更本无法连上。有人指出，自己的手机在同汽车连接后，可以播放音乐，但是不能接打电话。这一故障并非普遍存在。宝马、本田、讴歌、奔驰、日产、丰田与保时捷等车辆的驾驶者投诉居多。苹果未回复媒体就此提出的采访请求。一名车主表示，奔驰客服暗示，iPhone 6手机之所以无法连接，是因为这款设备尚未与汽车制造商的导航系统同步。奔驰公司未立刻证实这一说法。这一故障似乎是iPhone 6的问题，而与近期发布的新系统iOS8无关。司机们指出，他们的iPhone 5与iPhone 5s在升级新系统后运行良好，但iPhone 6不行。旧金山一名女子表示，自己的iPhone 5与iPhone 5s可以在2010版讴歌上正常使用，但iPhone 6就会卡在设备发现阶段，无法找到汽车。重启或是将手机恢复至出厂模式也无助于解决问题。不过有一名技术顾问指出，在手机设置中更改了新iPhone 6的名称后，他的2015版本田雅阁就可以识别并成功连接手机。
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17日17日17日17日17日
7月16日下午14点，小米将会为我们带来多款神秘新品，新版小米电视很有可能会亮相。
是游戏网推出的一款专门为热衷手机网游用户量身定制的游戏助手。
推荐点击榜《人民日报》载文指出,要把现实和理想联系起来,决不能只顾眼前而忘记远大理想,也决不能离开现实努力而空谈远大理想.这说明①理想对人生、对社会有着重大的积极影响②理想要转化为现_作业帮
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《人民日报》载文指出,要把现实和理想联系起来,决不能只顾眼前而忘记远大理想,也决不能离开现实努力而空谈远大理想.这说明①理想对人生、对社会有着重大的积极影响②理想要转化为现
《人民日报》载文指出,要把现实和理想联系起来,决不能只顾眼前而忘记远大理想,也决不能离开现实努力而空谈远大理想.这说明①理想对人生、对社会有着重大的积极影响②理想要转化为现实,需要艰苦奋斗③理想与现实是紧密相联的④提倡艰苦奋斗,是由我国的基本国情决定的A.①②③B.②③④C.②③D.①②③④
答案C理想与现实是辩证统一的,有着密切联系.理想来源于现实.理想源于现实,高于现实,又可以转化为现实.理想的实现需要多方面的条件,而从主观方面说,特别需要艰苦奋斗,同时要与崇高的社会理想结合起来.目的片段和载体连接问题(载体连接,载体,摩尔比)
03:06:01&&&来源：&&&评论：&&
[目的片段和载体连接问题(载体连接,载体,摩尔比)] 大家好！在做连接时遇到如下问题：载体说明书上说Vector DNA 和Insert DNA的摩尔比一般为1：2~10，请教应该怎样计算目的片段的摩尔数？谢谢大家！ 关键词:[载体连接 载体 摩尔比]…
大家好！在做连接时遇到如下问题：载体说明书上说Vector
和Insert 的摩尔比一般为1：2~10，请教应该怎样计算目的片段的摩尔数？谢谢大家！
回复做连接时，不一定非得要按照摩尔比，尤其做双酶切后的连接。当然如果一次连接不成功，可以这样来做。计算摩尔比一般简化如下：（假设载体5000bp、外源基因1000bp）回复其实只要估计一下就行了，没有那么严格，特别容易连接转化，不用担心太多。回复谢谢楼上两位，现在已经能连上了
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