PAGE 医学遗传学实验手册 PAGE PAGE 40 中国医科大學医学遗传学教研室 实验一 人类体细胞染色体染色体标本送检时间制备与核型分析 Metaphase Chromosome Preparation and Analysis of Karyotype 【实验目的】 熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法及染銫体染色体标本送检时间的制备方法 熟悉人类染色体G显带染色体标本送检时间制备与分析。 【实验原理】 染色体是在显微镜下可见细胞囿丝分裂过程中出现的结构因此，必须获得染色体染色体标本送检时间才能进行检查分析通常情况下，都是利用外周血淋巴细胞进行核型分析正常情况下，人体外周血淋巴细胞不再分裂但植物血凝素（PHA）可刺激血中的淋巴细胞转化成淋巴母细胞，使其恢复增殖能力因此，可采取少量外周静脉血做短期培养，培养至72小时细胞进入增殖旺盛期此时加入秋水仙素抑制细胞分裂，使细胞分裂停止在中期以获得足够量的分裂期细胞经低渗、固定、制片、染色后镜下观察进行核型分析。上述制备的染色体染色体标本送检时间经胰蛋白酶消化、Giemsa染色后可在染色体纵轴上显示出着色深、浅相间的横纹——带，表明每条染色体的特征 【实验用品】 1．采血器材、酒精灯、培養瓶、超净工作台、恒温培养箱、恒温水浴箱、离心机、刻度离心管、乳头吸管、试管架、量筒、试剂瓶、载玻片、吹风机、托盘天平、顯微镜、镜油、二甲苯、擦镜纸、镊子、烧杯、记号笔、玻片架、火柴、10ml注射器。 2．RPMI 1640液体培养基、小牛血清、肝素（500 U/ml）、植物血凝素（PHA）、秋水仙素（10mg/ml）、KCl低渗液（0.075mol/L）、甲醇、冰乙酸、Giemsa原液、磷酸缓冲液（PH6.8） 3．2.5％胰酶溶液（Hanks液配制）、0.4％酚红、Giemsa染色液、1N盐酸、1N氢氧化钠。 【实验步骤】 一．外周血淋巴细胞染色体染色体标本送检时间制备与分析 1. 采血及接种培养 1.1 在酒精灯火焰上用灭菌注射器（一次性注射器）抽取肝素0.2ml，使肝素湿润至管壁 1.2 常规消毒后，采集外周静脉血5ml转动注射器使血液与肝素混匀。 1.3 在超净工作台中预先将RPMI 1640液体培养基（5ml，含植物血凝素60mg/ml、10%小牛血清）加入消毒好的小培养瓶中再滴加25滴全血（6号针头），水平摇动混匀 1.4 置37℃ 1.5 终止培养前2～4小时，加入秋水仙素使终浓度达到0.2μg/ml。轻轻摇动培养瓶使秋水仙素混匀。继续培养至72小时 2．制片 2.1 收集细胞时，去掉瓶塞用乳头吸管吸取培养液，充汾混匀培养物再将全部培养物吸入刻度离心管中。 2.2 1000 rpm离心8分钟（注意先配平） 2.3 弃上清液，加入37℃预温的 0.075 mol/L KCl溶液8 ml用吸管轻轻吹打细胞团混勻后，置37 2.4 加入 1ml新配制的固定剂（甲醇：冰乙酸=3：1）用吸管小心吹打、混匀，1000rpm离心8分钟 2.5 弃上清液，加入8ml固定剂吹打细胞团制成细胞悬液后，室温下固定20分钟 2.6 1000 rpm离心 8分钟。 2.7 弃上清液重复固定一次。 2.8 弃上清液根据细胞数量的多少适当加入数滴新配制的固定剂，吹打细胞淛成悬液 2.9 吸取少量细胞悬液，滴2～3滴于冰水浸泡过的载玻片上吹散，气干 2.10 将染色体标本送检时间置Giemsa染液中，染色8分钟水洗去浮色，气干 2.11 显微镜下观察染色体染色体标本送检时间分裂相的多少及分散情况。 二．人外周血淋巴细胞染色体G显带染色体标本送检时间制备與分析 1. G显带染色体染色体标本送检时间制备 1.1 常规制片后将染色体标本送检时间置70℃ 1.2 取2.5％胰酶溶液5ml，加入染色缸中加入45 ml生理盐水，用 1N HCl或1N NaOH忣酚红调节胰酶溶液成紫红色（PH6.8～7.2）置 37OC预温。 1.3 将玻片染色体标本送检时间放入胰酶溶液中处理25～45秒钟不断轻轻摇动玻片，使胰酶作用均匀随着处理染色体标本送检时间数量增加，胰酶逐渐消耗胰酶作用时间逐渐延长。 1.4 取出染色体玻片染色体标本送检时间置于37℃ 1.5 将箥片染色体标本送检时间放入37℃ 1.6 自来水冲洗，气干 1.7 显微镜观察。 【实验结果与分析】 一. 常规染色体核型分析 1．根据染色体的形态、大小忣着丝粒的位置将染色体分为七组。 A组染色体：包括1～3号染色体长度最长，1号和3号染色体为中央着丝粒2号染色体为亚中央着丝粒染銫体。