：促进神经损伤能自行恢复吗组織修复的材料和方法

本发明是在国立健康研究院(National Institutes of Health)资金No.R01 NS37901资助的研究项目下由政府资助完成的政府在这个发明中享有某些权利。

相关申请的茭叉引用本申请要求2001年8月13日递交的临时专利申请序列号No.60/311,870的权益兹将其全文并入作为参考，包括所有的插图、表格和附图

周围神经损伤能自行恢复吗损伤是长期丧失劳动力的一个主要起因。较差的神经损伤能自行恢复吗损伤治疗伴随着肌肉萎缩并且当断离的轴突不能与遠侧神经损伤能自行恢复吗重建连续性时可以导致令人痛苦的神经损伤能自行恢复吗瘤。虽然神经损伤能自行恢复吗在损伤后具有再生的潛力这个能力严格地取决于再生神经损伤能自行恢复吗纤维(及其轴突芽)与断离的神经损伤能自行恢复吗段(以及其中的施旺细胞基膜)进行適当的接触。未能横穿间隙或损伤部位并进入断离的远侧神经损伤能自行恢复吗段的基膜的再生轴突将会溃变导致神经损伤能自行恢复嗎元死亡、肌肉萎缩和永久的机能缺失(Fawcett

简要地，神经损伤能自行恢复吗携带神经损伤能自行恢复吗元的周围突起(或轴突)神经损伤能自行恢复吗元胞体位于脊髓中(运动神经损伤能自行恢复吗元)、沿着脊柱的神经损伤能自行恢复吗节中(脊髓感觉神经损伤能自行恢复吗节)或者遍咘全身器官的神经损伤能自行恢复吗节中(自主和肠神经损伤能自行恢复吗节)。神经损伤能自行恢复吗由轴突、施旺细胞和大量的结缔组织鞘组成(Dagum AB J Hand Ther )外覆层神经损伤能自行恢复吗外膜是由缓冲神经损伤能自行恢复吗束的外部压力并且围绕神经损伤能自行恢复吗束膜的胶原性结締组织构成的。神经损伤能自行恢复吗束膜环绕每束神经损伤能自行恢复吗纤维并且与神经损伤能自行恢复吗内膜微血管中的内皮细胞┅起，行使血-神经损伤能自行恢复吗屏障的功能神经损伤能自行恢复吗内膜位于神经损伤能自行恢复吗束膜的内部，并且由环绕施旺细胞和轴突的胶原性组织组成神经损伤能自行恢复吗束组(fascicular group)由两个或更多个分别被神经损伤能自行恢复吗束膜和神经损伤能自行恢复吗外膜環绕的神经损伤能自行恢复吗束(fascicle)组成。神经损伤能自行恢复吗的远侧局部解剖图是稳定的或者是一组感觉神经损伤能自行恢复吗束或者昰一组运动神经损伤能自行恢复吗束。神经损伤能自行恢复吗元由胞体(细胞体)和轴突组成轴突可以是数英尺长。

当神经损伤能自行恢复嗎损伤存在轴突破坏、但是神经损伤能自行恢复吗内膜鞘的连续性完整无损(例如挤压伤)的时候，轴突在它们原来的基膜内再生并且彻底痊愈是可以预期的。相反轴突再生在神经损伤能自行恢复吗横断之后受到严重地影响，而且外科手术恢复高度地依赖于如上所述的神經损伤能自行恢复吗元件的重新对接(realignment)(Dagum AB J Hand Ther PressNorfolk)。尽管存在当前显微外科技术的技术现状但由于神经损伤能自行恢复吗精细的显微结构和不能实現的轴突到轴突的精确接合，在神经损伤能自行恢复吗横断修复之后功能的完全恢复仍然是一个不能及的理想

神经损伤能自行恢复吗切除术为神经损伤能自行恢复吗移植提供了正当理由，但存在若干实际问题这些年来，已经探索了各种神经损伤能自行恢复吗移植物的备選方案目前被视为有发展前途的备选方案是关于同种异体神经损伤能自行恢复吗移植物的应用。虽然供体移植物可获得性遇到其它器官替代策略的困难但神经损伤能自行恢复吗移植物中细胞元件的存活可能远不是那么重要。尽管施旺细胞明显有助于再生过程但神经损傷能自行恢复吗鞘结构已含有促进轴突再生的必要脚手架和粘性线索(adhesive )。杀死定居的抗原递呈细胞(例如施旺细胞、成纤维细胞、内皮细胞等)鈳以使移植物的免疫原性大为降低利用无细胞神经损伤能自行恢复吗移植物极大地降低或消除了宿主-移植物免疫排斥的顾虑(Evans PJ等Prog Neurobiol ；Evans PJ等Muscle Nerve 2)。这些特性为冷冻杀死的(无细胞)同种异体和异种神经损伤能自行恢复吗移植物的应用提供了可观的前景另一方面，没有存活细胞预先排除了看似促进再生过程的神经损伤能自行恢复吗变性以及随后的重塑(Bedi KS等Eur JNeurosci ；Danielsen N等Brain Res )

层粘连蛋白是基膜主要的生长促进成分，其是用于轴突成功再生嘚粘性刺激物(WangGY等Brain Res )。然而虽然正常(未受损伤的)神经损伤能自行恢复吗具有丰富的层粘连蛋白，正常神经损伤能自行恢复吗仍然抑制或者抵抗轴突生长(Langley JN JPhysiol ；Brown MC等EurJNeurosci )这意味着层粘连蛋白的生长促进活性在正常神经损伤能自行恢复吗环境下被抑制，而且层粘连蛋白活性在神经损伤能洎行恢复吗变性中必须以某种方式被恢复从而确保再生

)。一旦神经损伤能自行恢复吗损伤断离的节段(损伤远侧)经历广泛的变性(degeneration)过程，引起广泛的重塑(remolding)在创伤诱导的神经损伤能自行恢复吗变性中，断离的轴突死亡它们的髓鞘碎片和产生的残骸通过吞噬作用清除。尽管存在这种变性鞘结构和基膜仍保存下来。施旺细胞增生并为神经损伤能自行恢复吗作好轴突再生的准备这整个的过程，包括重塑方面通常被称作为神经损伤能自行恢复吗变性。现在清楚神经损伤能自行恢复吗损伤导致远侧神经损伤能自行恢复吗段的积极改变并且实驗证明变性的神经损伤能自行恢复吗比正常神经损伤能自行恢复吗具有更大的轴突生长促进潜力(Bedi

与神经损伤能自行恢复吗损伤有关的功能喪失因轴突破坏而引起。轴突非常细且脆因而最轻微的损伤(包括受压)都可以导致断离反应(轴索切断)。在轴索切断中损伤远侧的轴突死亡并且变性。对于神经损伤能自行恢复吗来说问题最小的损伤是挤压伤(轴索断伤)其中发生轴索切断，但是神经损伤能自行恢复吗鞘的连續性保持完整在轴索断伤的情况下，由于基膜保持连续轴突典型地无需外科手术的干预就得以再生。为使断离的周围神经损伤能自行恢复吗成功地再生自近侧神经损伤能自行恢复吗残段萌发的轴突芽首先必须定位之后进入远侧神经损伤能自行恢复吗段的施旺细胞基膜內。这一决定性必要条件被认为造成了与挤压伤相比神经损伤能自行恢复吗横断后相对较差的再生在神经损伤能自行恢复吗横断(神经损傷能自行恢复吗断伤)中，神经损伤能自行恢复吗部分或者完全地断离横断损伤中轴突和神经损伤能自行恢复吗鞘都断离，破坏了神经损傷能自行恢复吗连续性和轴突再生所需的引导机制重建神经损伤能自行恢复吗的神经损伤能自行恢复吗元件的连续性的外科接合术(神经損伤能自行恢复吗缝合术)对于轴突再生是必要的。此外神经损伤能自行恢复吗横断和修复后的轴突再生也会因为近侧和远侧元件的未对准而复杂化。即使是在尖锐器械利落横断的例子中整个神经损伤能自行恢复吗结构也会被破坏。肿胀以及轴浆自切口端的外流导致迅速增生效应其干扰基膜脚手架的准确接合和重新对接。尽管通过显微外科技术可以改善神经损伤能自行恢复吗束的对接轴突-轴突的接合仍然是一个理想化的目标。由于轴突的小尺寸以及结缔组织的相对优势多数在外科手术接合后从近侧残段萌发的轴突芽最有可能首先遭遇富含抑制性硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)的非许可性基质。这可能解释了与周围神经损伤能自行恢复吗横断修复相关联的显著的潜代期和不稳定嘚再生证据显示CSPGs结合层粘连蛋白并抑制其生长促进活性，并且CSPG在损伤后的变性过程中将被降解从而，使CSPGs失活的此过程能够解释为何变性对于神经损伤能自行恢复吗再生是必要的最近发现周围神经损伤能自行恢复吗含有丰富的CSPG，其抑制神经损伤能自行恢复吗内膜层粘连疍白的生长促进活性(Zuo Neurosci)所以，任何神经损伤能自行恢复吗微细结构的未对准(在损伤和修复后)都将迫使再生的轴突芽遇到非许可性组织的干涉这可能严重地限制了它们进入远侧神经损伤能自行恢复吗的基膜。最近的研究支持某些CSPG降解酶是层粘连蛋白的生长促进特性可在变性嘚神经损伤能自行恢复吗内藉以恢复的一种机制的结论(Zuo J等[1998b]J Neurosci 1；Ferguson TA等Mol Cell

虽然软骨素酶ABC(一种糖胺聚糖裂解酶)降解硫酸软骨素、硫酸皮肤素和透明质酸鹽其增强神经损伤能自行恢复吗组织的生长促进特性的能力归功于CSPG降解(Zuo J等Exp Neurol ；Ferguson TA等Mol Cell Neurosci )。此外已经证明软骨素酶ABC治疗不会破坏神经损伤能自行恢复吗鞘的组织或者将层粘连蛋白从施旺细胞基膜中转移出来(Krekoski

在神经损伤能自行恢复吗横断修复模型中，对抑制性CSPG的降解去除了再生轴突芽的一个主要障碍并导致其向远侧神经损伤能自行恢复吗更加茁壮和一致的生长(Krekoski CA等J Neurosci 3)。

已经证明变性的神经损伤能自行恢复吗具有提高的支持轴突生长的能力(Giannini C等J Neuro pathol Exp Neurol ；Hasan N等J Anat)变性的作用很可能归因于神经损伤能自行恢复吗基膜的改变，因为在从预变性的神经损伤能自行恢复吗制备嘚无细胞移植物中轴突再生也得以改善(Danielsen N等Brain Res )在整个变性过程中，施旺细胞基膜保持结构完整

动物模型已经证明从体内预变性的神经损伤能自行恢复吗制备的移植物在支持神经损伤能自行恢复吗再生方面要比新鲜切除的移植物好得多(Danielsen N等Brain Res )。不过建立预变性神经损伤能自行恢複吗的方法(即，神经损伤能自行恢复吗损伤后继之以一段体内存活期以允许组织变性)在人体中是不切实际的

体内周围神经损伤能自行恢複吗变性导致几种细胞外基质分子的周转提高，这取决于神经损伤能自行恢复吗元、施旺细胞以及侵入的巨嗜细胞对蛋白水解酶的释放和活化损伤后基质金属蛋白酶(MMP)活性的调节暗示MMP-2和MMP-9在神经损伤能自行恢复吗变性和再生期间参与胞外基质的重塑(La Fleur等J Exp Med 6；Kherif等Neuropathol Appl Neurobiol

体外变性导致神经损傷能自行恢复吗外植块的神经损伤能自行恢复吗突促进活性得到实质上的提高。这种提高通过添加MMP抑制剂被封阻同时发生的净明胶水解活性的提高也被封阻(由原位酶谱证明)。在培养的神经损伤能自行恢复吗外植块中神经损伤能自行恢复吗突促进活性迅速上升并且与MMP-2的上調和活化平行。相反体内变性的最初效果仅仅是抑制正常神经损伤能自行恢复吗原本就很低的神经损伤能自行恢复吗突促进活性，在此期间MMP-2的体内表达或活化没有变化不过，横断神经损伤能自行恢复吗的神经损伤能自行恢复吗突促进活性确实在体内随着时间提高并且這与突然爆发的MMP-2的表达和活化相对应(Ferguson和Muir，2000Mol

体外试验显示体内预变性的神经损伤能自行恢复吗段比正常神经损伤能自行恢复吗段具有较大嘚神经损伤能自行恢复吗突促进活性(Bedi等Eur J Neurosci ；Agius等JNeurosci ；Ferguson等Mol Cell Neurosci )。不过体内测试预变性的神经损伤能自行恢复吗移植物的研究产生了与之矛盾的结果，特别是当利用细胞(活)神经损伤能自行恢复吗移植物的时候(Gordon等JHand Surg )这说明，在变性时细胞和分子机制起着增强基膜的生长促进特性的作用，嘫后其在细胞元件被杀死后保留了刺激神经损伤能自行恢复吗再生的能力体外预变性可以导致无细胞神经损伤能自行恢复吗移植物的生長促进能力相当程度地提高，这在本发明的低温培养和移植模型中很容易地得到了证明无细胞神经损伤能自行恢复吗移植与轴突再生开始的实质性延迟相关联(Danielsen等Brain Res )。

许多关于神经损伤能自行恢复吗外植块培养物和神经损伤能自行恢复吗移植物保存的研究聚焦于神经损伤能自荇恢复吗段的冷藏与促进培养中神经损伤能自行恢复吗移植物的有限变性的努力不同，冷藏法目的是在最低限度的缺血性条件下保存神經损伤能自行恢复吗以抑制细胞和蛋白水解活性Levi等(Levi A等Glia )发现冷藏1周后细胞存活力显著下降，并且在冷藏3周后仅有少量存活的施旺细胞残留茬神经损伤能自行恢复吗外植块中后来，Lassner等(Lassner等J Reconstr Microsurg )报道培养基(DMEM而非冷藏液)对于维持施旺细胞存活力以及对于冷藏缺血条件下贮藏的神经损傷能自行恢复吗移植物的再生潜力具有正面效果。虽然不利于神经损伤能自行恢复吗移植物的生长促进潜力的最优化持续冷藏确实会进┅步降低细胞存活力、免疫原性以及同种异体神经损伤能自行恢复吗移植物免疫排斥的问题(Evans等MuscleNerve 2)。鉴于这个原因延长的冷藏和冷冻杀死的鉮经损伤能自行恢复吗同种异体移植物比新鲜同种异体移植物导致更好的再生(Evans等Microsurgery )。

从而本领域仍然需要可以用于改善传统神经损伤能自荇恢复吗修复结果的低风险辅助疗法。

发明概述本发明涉及促进神经损伤能自行恢复吗组织修复的组合物和方法在一个优选的实施方式Φ，本发明的组合物包含硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)-降解酶在一个实施方式中，本发明的组合物包含从由软骨素酶、透明质酸酶、及基质金属疍白酶(MMP)、或其组合组成的组中选择的CSPG降解酶在另一个实施方式中，本发明的组合物包含从由软骨素酶ABC、软骨素酶A、软骨素酶C、软骨素酶AC、透明质酸酶、MMP-2、及MMP-9、或其组合组成的组中选择的CSPG降解酶

本发明还涉及促进人或动物损伤的神经损伤能自行恢复吗组织修复的方法。本發明的方法包括向神经损伤能自行恢复吗修复、接合、移植物、或者损伤的神经损伤能自行恢复吗给药一种或多种CSPG-降解酶本发明的方法妀善再生轴突越过神经损伤能自行恢复吗-神经损伤能自行恢复吗或神经损伤能自行恢复吗-移植物界面的能力，并增强基膜脚手架内的轴突苼长抑制性CSPG的降解建立了一个更加许可的神经损伤能自行恢复吗基质，并且允许轴突芽更好地进入神经损伤能自行恢复吗的施旺细胞基膜从而增加成功伸入损伤的神经损伤能自行恢复吗组织或植入的神经损伤能自行恢复吗移植物的轴突的数目。此外这也使得轴突芽可鉯采取正确的路径，从而导致功能恢复进一步的改善

本发明还涉及通过用CSP-降解酶处理制备神经损伤能自行恢复吗移植物的方法。优选地神经损伤能自行恢复吗移植物(同种异体的或者异种的)是新鲜和没有变性的，并且在神经损伤能自行恢复吗移植物冷冻之前或之后用CSPG-降解酶处理如果是在移植物的细胞活着的时候处理的，则移植物可以就此植入或者随后被冷冻杀死使之无细胞化。在一个实施方式中神經损伤能自行恢复吗组织在处理后被无细胞化。在一个优选的实施方式中神经损伤能自行恢复吗组织通过冷冻杀死无细胞化。

本发明还涉及培养新鲜(或者为运输而短暂保存)的神经损伤能自行恢复吗组织用于随后作为神经损伤能自行恢复吗移植物植入人或动物体内的方法優选地，从人或动物供体中收获新鲜的神经损伤能自行恢复吗组织并在允许组织离体发生变性和重塑的生理条件下培养，通过内源性过程促进施旺细胞在组织内的增生和基膜的活化在一个实施方式中，神经损伤能自行恢复吗组织/移植物在培养后被无细胞化在一个优选嘚实施方式中，神经损伤能自行恢复吗组织/移植物通过冷冻杀死被无细胞化

本发明进一步涉及提供用于植入人或动物体内的神经损伤能洎行恢复吗移植物的方法。优选地供体移植物的横断面特征与植入部位的神经损伤能自行恢复吗组织横断面特征相似。

图1A-1D显示了软骨素酶处理的无细胞神经损伤能自行恢复吗移植物的CSPG新表位(neoepitope)免疫荧光无细胞(冷冻杀死的)大鼠坐骨神经损伤能自行恢复吗段整个用软骨素酶ABC在體外处理16小时。图1A显示了由Ab1918标记的新表位(软骨素酶-依赖性)证明用软骨素酶整体处理有效地渗透所有的神经损伤能自行恢复吗区室并且降解CSPG侧链。在图1B中Ab1918免疫标记的强度并不因为用软骨素酶额外处理图1A中所示神经损伤能自行恢复吗的切片而增加，说明最初的整体处理是彻底的在图1C中，软骨素酶处理的无细胞神经损伤能自行恢复吗段中施旺细胞基膜的结构完整性通过层粘连蛋白免疫荧光证实图1D显示了8天後软骨素酶处理的无细胞居间神经损伤能自行恢复吗移植物的体内Ab1918免疫标记。

图2显示了通过由软骨素酶处理的无细胞神经损伤能自行恢复嗎段的低温培养生物试验反映的抑制性CSPG的失活无细胞神经损伤能自行恢复吗段整体用软骨素酶(″Ch′ase″)或单独用介质处理。进行神经损伤能自行恢复吗切片然后再用软骨素酶或仅用介质进行后处理。将分离的鸡胚DRG神经损伤能自行恢复吗元在该神经损伤能自行恢复吗切片上苼长24小时并如材料和方法中所述记录神经损伤能自行恢复吗突的长度。通过对每个条件下至少250个神经损伤能自行恢复吗元的评定进行测萣结果以平均值(-SEM)表示，并且利用Studentt检验比较整体施用介质和软骨素酶条件的统计学差异显著性*P＜0.001。

图3显示了居间无细胞神经损伤能自行恢复吗移植物的连续性和GAP-43免疫染色评估每个神经损伤能自行恢复吗移植物的连续性通过在纵切面上检测近侧和远侧神经损伤能自行恢复嗎-移植物的接合来证实。在近侧接合处GAP-43标记揭示众多的再生轴突进入移植物的近侧面。GAP-43不标记无细胞移植物中任何其余元件

图4显示了8忝后轴突再生进入无细胞居间神经损伤能自行恢复吗移植物。这一系列代表性的切片来自两个动物其均接受了介质处理和软骨素酶处理嘚移植物。从近侧移植物(1.2mm顶部)开始随后以0.56mm间隔获取的连续切片用GAP-43免疫标记。在每个接受双侧移植物的动物(n＝9)中较之于介质处理的对照，轴突生长更多地进入了用软骨素酶处理的无细胞移植物中图像在神经损伤能自行恢复吗外膜处进行修剪以接近图5中数字图像分析所评萣的视野。

图5显示了再生轴突能更多地进入用软骨素酶处理的无细胞神经损伤能自行恢复吗移植物中8-天的居间神经损伤能自行恢复吗移植物的连续切片(如图4所示)通过数字图像分析评定GAP-43-标记的轴突分布。数据代表在进入移植物内特定的距离处(从近侧到远侧)对9个介质处理的和9個软骨素酶处理的移植物评估的平均值(-SEM)

图6显示了4天后轴突再生进入无细胞居间神经损伤能自行恢复吗移植物的开始节段。对4天无细胞移植物的神经损伤能自行恢复吗-移植物界面以及紧近侧的区域进行了检测以比较进入移植物的0.3mm处的GAP-43-标记的轴突分布。数据代表3个介质处理嘚和3个软骨素酶处理的移植物的平均值(-SEM)

图7显示了移植物内轴突再生和施旺细胞迁移的联系。8天移植物的连续切片进行GAP-43(轴突)和S-100(施旺细胞)的免疫标记在软骨素酶处理的移植物的近侧区域，最常见施旺细胞与再生轴突紧密关联观察到偶然的没有与施旺细胞共迁移的轴突簇(箭頭)。在移植物较远侧常见没有伴随施旺细胞的轴突。在该移植物较远侧的区域几乎没有被S-100强烈地免疫标记的单个施旺细胞该区主要含囿与冷冻杀死的施旺细胞残骸相关的微弱的S-100染色。

图8A和8B显示了远侧移植物接合处轴突和施旺细胞的生长对8天的软骨素酶处理移植物和远側神经损伤能自行恢复吗残段的纵向连续切片进行GAP-43(轴突)免疫标记，如图8A中所示以及S-100(施旺细胞)免疫标记，如图8B中所示在图8A中，轴突(小箭頭)接近、穿过远侧接合处并在宿主远侧残段内扩散生长。在图8B中S-100标记的施旺细胞在宿主远侧残段中很丰富，但是即便有侵入移植物远側面的施旺细胞也是很少的(其主要含有与冷冻杀死的施旺细胞残骸相关的微弱的S-100免疫染色)。

图9A和9B分别显示了CSPG新表位和层粘连蛋白被染色嘚人神经损伤能自行恢复吗这些结果说明，虽然人神经损伤能自行恢复吗的总体结构比大鼠神经损伤能自行恢复吗更为复杂支持轴突洅生的基膜大体上相似，并且调控生长的分子成分(CSPG和层粘连蛋白)是丰富的图9A还通过新表位标记证明，CSPG侧链在软骨素酶处理的人类神经损傷能自行恢复吗段中被有效地降解

图10显示了利用人类神经损伤能自行恢复吗段通过低温培养试验反映的抑制性CSPG的失活。人神经损伤能自荇恢复吗用软骨素酶处理随之分析神经损伤能自行恢复吗突促进活性。分离的鸡DRG神经损伤能自行恢复吗元在切片上生长24小时并记录神经損伤能自行恢复吗突长度结果以平均值(-SEM)表示。利用Studentt检验比较介质处理和软骨素酶处理条件的统计学差异显著性(P＜0.001)

图11显示在一种人到大鼠的异种移植模型中轴突较好地生长进入软骨素酶处理的无细胞神经损伤能自行恢复吗移植物中。人神经损伤能自行恢复吗束(与大鼠坐骨鉮经损伤能自行恢复吗的直径相似)被移植到在大鼠坐骨神经损伤能自行恢复吗中制备的缺口中8天居间神经损伤能自行恢复吗异种移植物嘚连续切片通过数字图像分析来评定GAP-43标记的轴突分布图。数据代表在进入移植物内特定的距离(从近侧到远侧)对2个介质处理的和2个软骨素酶處理的移植物估定的平均值(-SEM)

图12A-12D显示了损伤的坐骨神经损伤能自行恢复吗中通过单次注射软骨素酶ABC发生的CSPG降解。检测了两种损伤模型双側神经损伤能自行恢复吗横断和修复(图12A、12B、和12D)以及双侧神经损伤能自行恢复吗挤压(图12C)。在损伤时右侧坐骨神经损伤能自行恢复吗用软骨素酶ABC(2μl 1U)在神经损伤能自行恢复吗损伤部位远侧2mm处注射神经损伤能自行恢复吗横断和修复后4天，CSPG-新表位免疫染色在接合部位的整个神经损伤能自行恢复吗内膜和神经损伤能自行恢复吗鞘中(图12A)(注意神经损伤能自行恢复吗外膜的缝合)以及距接合处数mm的整个远侧(图12B)和近侧(未显示)神经損伤能自行恢复吗横断面区域中均很强烈如图12C中所示，在软骨素酶注射后2天检测的挤压伤神经损伤能自行恢复吗中得到了相似的结果甴体内注射软骨素酶发生的CSPG的降解程度通过在组织切片后对软骨素酶第二次处理的神经损伤能自行恢复吗进行CSPG-新表位免疫标记来检测，如圖12D中所示在第二次应用后连续切片中的染色强度并不显著不同(比较图12B和图12D)，说明单次体内注射软骨素酶有效地降解了周围细胞外基质中嘚CSPG

图13A和13B显示了在神经损伤能自行恢复吗挤压伤后用软骨素酶ABC处理并不改变轴突再生。成年大鼠接受双侧坐骨神经损伤能自行恢复吗挤压傷并且一侧神经损伤能自行恢复吗用软骨素酶ABC注射，而对侧神经损伤能自行恢复吗仅接受介质损伤后两天取出神经损伤能自行恢复吗，并用GAP-43免疫细胞化学标记再生的轴突两只代表性动物中(均接受介质和软骨素酶注射)紧邻神经损伤能自行恢复吗挤压伤处远侧的再生轴突汾布图示于图13A。如图13B所示评定了远侧神经损伤能自行恢复吗连续切片中GAP-43-免疫标记的轴突。软骨素酶处理的(Ch′ase)神经损伤能自行恢复吗的轴突再生与介质处理的对照神经损伤能自行恢复吗相比没有显著差别数据代表进入远侧神经损伤能自行恢复吗内每隔0.56mm对6个软骨素酶处理的囷6个介质处理的神经损伤能自行恢复吗估定的平均值(±SEM)。

图14A和14B显示了在神经损伤能自行恢复吗横断和神经损伤能自行恢复吗缝合修复后用軟骨素酶ABC处理显著增强了轴突再生成年大鼠接受双侧神经损伤能自行恢复吗横断以及端到端的修复。一侧神经损伤能自行恢复吗用软骨素酶ABC注射而对侧神经损伤能自行恢复吗仅接受介质。损伤后4天取出神经损伤能自行恢复吗并用GAP-43免疫细胞化学标记再生的轴突。两只代表动物中(均接受介质和软骨素酶注射)紧邻神经损伤能自行恢复吗接合处远侧的再生轴突的分布图示于图14A如图14B所示，评定了远侧神经损伤能自行恢复吗连续切片中GAP-43-免疫标记的轴突软骨素酶处理的(Ch′ase)神经损伤能自行恢复吗中轴突再生比介质处理的对照显著增强。数据代表进叺远侧神经损伤能自行恢复吗内每隔0.56mm对7个软骨素酶处理的和7个介质处理的神经损伤能自行恢复吗估定的平均值(±SEM)

图15A和15B显示了神经损伤能洎行恢复吗外植块培养物的低温培养试验。如图15A所示新鲜切除的大鼠坐骨神经损伤能自行恢复吗外植块在含有0、2或10％胎牛血清的DMEM/N2中培养1、2、4和7天。如图15B所示神经损伤能自行恢复吗外植块在不添加和添加GM6001(MMP抑制剂)的含有2％血清(培养标准)的DMEM/N2中培养2天。然后冷冻切片神经损伤能洎行恢复吗并在含有NGF的DMEM/N2中在组织切片上种植胚性DRG神经损伤能自行恢复吗元。24小时后对DRG神经损伤能自行恢复吗元进行GAP-43免疫染色，并通过數字显微照相和图像分析测量神经损伤能自行恢复吗突生长对照条件是正常神经损伤能自行恢复吗(培养0天)。数据代表在每一条件下评定嘚大于250个神经损伤能自行恢复吗元的神经损伤能自行恢复吗突长度平均值(±SEM)其中所述神经损伤能自行恢复吗元来自2个或更多个独立实验Φ测试的至少4个独立神经损伤能自行恢复吗外植块培养物。

图16显示了神经损伤能自行恢复吗外植块培养物的酶谱分析神经损伤能自行恢複吗外植块在含有2％血清的DMEM/N2中培养0(对照，C)、1、2、4和7天然后提取神经损伤能自行恢复吗并通过明胶覆盖电泳分析。酶谱揭示了酶原形式和活化形式的明胶酶其在着色的凝胶内显示为透明的条带。对照神经损伤能自行恢复吗主要地含有MMP-2原和痕量活化的MMP-2在培养2天或更长时间嘚神经损伤能自行恢复吗外植块中，存在着MMP-2含量的渐进增长以及向活性形式的迅速转化MMP-9在对照及早期外植块中可以忽略不计，然而在第4囷第7天检测到痕量分子量指示重组人MMP-9原(92kD)、活化MMP-9(84kD)、MMP-2原(72kD)和活化MMP-2(66kD)的位置。

图17A-17F显示了通过原位酶谱对神经损伤能自行恢复吗段中净明胶水解活性嘚定位对照神经损伤能自行恢复吗(图17A和图17B)和培养的神经损伤能自行恢复吗外植块(2天，2％血清)(图17C和图17D)的组织切片用淬灭的荧光素标记的明膠覆盖该明胶可以被组织内的明胶水解活性转化为荧光肽。在正常神经损伤能自行恢复吗中检测到组成型明胶水解活性(图17A)其在更高的放大倍数(图17B)下与施旺细胞相关联。如图17C和17D所示在培养的神经损伤能自行恢复吗中明胶水解活性更加强烈，并且散布在培养神经损伤能自荇恢复吗的整个神经损伤能自行恢复吗内膜中如图17E和17F所示，在GM6001存在的条件下培养的神经损伤能自行恢复吗中明胶水解活性显著下降

图18A-18D顯示了培养的神经损伤能自行恢复吗外植块中MMP-2和MMP-9的免疫表达。如图18A所示培养神经损伤能自行恢复吗(2天，2％血清)的MMP-2免疫标记在施旺细胞和周围的基膜(插图)内强烈在图18B中，S-100免疫标记显示了扩增的施旺细胞群在神经损伤能自行恢复吗内的重定位如图18C所示，MMP-9免疫标记在神经损傷能自行恢复吗束内事实上是不存在的除了罕见的细胞分布之外。周围的神经损伤能自行恢复吗外膜中的一些细胞被MMP-9免疫标记在图18D中，OX42标记显示了散布于整个神经损伤能自行恢复吗外膜而少见于培养神经损伤能自行恢复吗的神经损伤能自行恢复吗束内的巨噬细胞

图19A-19D显礻了培养的神经损伤能自行恢复吗外植块中的沃勒氏变性。培养2天的神经损伤能自行恢复吗段中观察到的变性改变是体内观察到的早期沃勒氏变性的记忆在图19A中，神经损伤能自行恢复吗丝免疫标记显示与如图19B(图19A和19B插图，纵向切片)中所示的培养的神经损伤能自行恢复吗外植块(2天2％血清)中环状和片段化的轴突不同，正常神经损伤能自行恢复吗中形成紧凑且连续的轴突如图19C所示，层粘连蛋白免疫标记显示基膜结构完整并且层粘连蛋白表达在施旺细胞中被上调(插图)。如图19D所示轴突变性和由施旺细胞引起的髓鞘质突出在用甲苯胺蓝着色的半薄切片中尤为明显。如图19D插图中所示在培养2天的神经损伤能自行恢复吗段中未观察到导致进一步髓鞘质变性(崩解和浓缩)和吞噬作用清除的变性过程。

图20A和20B显示了体外预变性的无细胞神经损伤能自行恢复吗移植物中的轴突再生正常和培养(2天，2％血清)的神经损伤能自行恢複吗移植物被冷冻杀死修剪至10mm的长度，并用作为居间移植物来修复横断的坐骨神经损伤能自行恢复吗宿主大鼠接受双侧移植物，一侧為正常的(未培养的)而一侧为预变性的(培养的)。8天后通过评定横切片中的GAP-43-免疫阳性分布图来评估轴突再生在图20A中，显示了有代表性的来洎两个动物的对照和预变性移植物的切片切片显示进入移植物1.5mm处的轴突再生。免疫荧光图像的象素值被反转如图20B所示，按测定的进入迻植物的距离进行定量分析数据代表各种条件下6个神经损伤能自行恢复吗的平均值(±SEM)。

发明的详细公开本发明提供了促进神经损伤能自荇恢复吗组织修复的组合物和方法本发明的组合物和方法可被用来恢复因疾病、创伤事件或外科手术操作中断的神经损伤能自行恢复吗嘚连续性。本发明的组合物和方法通过增加成功穿入损伤的神经损伤能自行恢复吗组织或植入的神经损伤能自行恢复吗移植物的轴突的数目促进神经损伤能自行恢复吗组织修复导致更好的功能恢复。

在一个优选的实施方式中本发明的组合物包括硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)-降解酶。在一个实施方式中本发明的组合物包括从由软骨素酶、透明质酸酶、及基质金属蛋白酶(MMP)、或其组合构成的组中选择的CSPG-降解酶。在另┅个实施方式中本发明的组合物包括从由软骨素酶ABC、软骨素酶A、软骨素酶C、软骨素酶AC、透明质酸酶、MMP-2、及MMP-9、或其组合构成的组中选择的CSPG-降解酶。

CSPG-降解酶可以是人类、动物或细菌来源的天然存在或者重组的。如本文所用的术语“CSPG-降解酶”还旨在包括这类酶的生物学活性爿段和变体，例如保留了实质量的CSPG-降解活性的那些片段和变体本发明的组合物可以包括适当的药学载体。本发明进一步涉及用一种或多種CSPG-降解酶处理的神经损伤能自行恢复吗组织

除了一种或多种CSPG-降解酶以外，本发明的组合物可以进一步包括生物或药学活性分子例如生長因子。这类生长因子包括但不限于，神经损伤能自行恢复吗生长因子(NGF)、成纤维细胞生长因子(FGF-1和2)、表皮生长因子(EGF)、睫状神经损伤能自行恢复吗营养因子(CNTF)、脑源神经损伤能自行恢复吗营养因子(BDNF)、神经损伤能自行恢复吗营养蛋白-3、-4和-5(NT-3、-4和-5)、胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I、II)、转化生长因孓(TGF)、胶质细胞生长因子-2(GGF-2)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、以及淋巴细胞浸润因子/胆碱能分化因子(LIF/CDF)这类分子可以洎天然来源或通过重组DNA技术获得。还可以利用保留其生物或药学活性的这类分子的片段或变体

本发明还涉及促进人类或动物损伤的神经損伤能自行恢复吗组织修复的方法。本发明的方法包括向神经损伤能自行恢复吗移植物或损伤的神经损伤能自行恢复吗组织施用一种或多種CSPG-降解酶本发明的方法改善再生轴突越过神经损伤能自行恢复吗-神经损伤能自行恢复吗或神经损伤能自行恢复吗-移植物界面的能力，并使基膜脚手架内部的轴突生长得以增强抑制性CSPG的降解建立了一个更加许可的神经损伤能自行恢复吗基质(nerve substratum)，并且允许轴突芽更好地进入神經损伤能自行恢复吗的施旺细胞基膜从而增加成功地穿入损伤的神经损伤能自行恢复吗组织或植入的神经损伤能自行恢复吗移植物的轴突的数目。

向损伤的神经损伤能自行恢复吗施用CSPG-降解酶在一个实施方式中，CSPG-降解酶被施用于损伤的神经损伤能自行恢复吗、神经损伤能洎行恢复吗损伤部位或者神经损伤能自行恢复吗损伤修复部位在一个优选的实施方式中，CSPG-降解酶被施用于主要的神经损伤能自行恢复吗修复部位包括断离或修剪的神经损伤能自行恢复吗的接合(即端到端的神经损伤能自行恢复吗接合)部位。神经损伤能自行恢复吗损伤可以昰神经损伤能自行恢复吗横断(神经损伤能自行恢复吗断伤)其中神经损伤能自行恢复吗部分或者完全地断离，或者是小范围损伤并通过外科手术切除而且神经损伤能自行恢复吗外膜接合术(神经损伤能自行恢复吗缝合术)是修复此损伤神经损伤能自行恢复吗的主要方法。举例來说本发明的组合物和方法可被用来促进涉及损伤神经损伤能自行恢复吗的至少一种神经损伤能自行恢复吗鞘的连续性中断的神经损伤能自行恢复吗损伤的修复，所述神经损伤能自行恢复吗鞘例如基膜、神经损伤能自行恢复吗束膜或神经损伤能自行恢复吗外膜优选地，外科手术修复旨在重新对接神经损伤能自行恢复吗元件

在一个具体的实施方式中，神经损伤能自行恢复吗损伤为挤压伤(轴索断伤)或更极端的损伤其中发生轴索切断，但是神经损伤能自行恢复吗鞘的连续性保持完整或者稍微受到损害在轴索断伤的情况下，轴突典型地无需外科手术的干预就得以再生

在某些情况下，神经损伤能自行恢复吗段是病态的、被无可挽回地损伤或者闭塞的并通过外科手术切除。修复可以包括植入移植物或修补物以桥接断口植入物可以天然的(例如，神经损伤能自行恢复吗或血管移植物)、天然衍生物(例如生物聚合物管)或合成导管(聚硅氧烷管)。这些物质被连接到切断的神经损伤能自行恢复吗端在一个具体的实施方式中，CSPG-降解酶被施用于连接部位在任一端或者两端。举例来说CSPG-降解酶可以被施用于居间移植物上一处或两处的宿主-移植物界面。CSPG-降解酶可以在外科手术修复损伤的鉮经损伤能自行恢复吗组织或者将移植物植入受体内之前、期间或之后施用

向神经损伤能自行恢复吗移植物施用CSPG-降解酶。在一个实施方式中CSPG-降解酶被施用于神经损伤能自行恢复吗移植物。当CSPG-降解酶被施用于神经损伤能自行恢复吗移植物时可以处理整个移植物。CSPG-降解酶鈳以施用于整个神经损伤能自行恢复吗移植物作整体处理这种施用为移植前的预处理或者温育，并且可以包括或可以不包括除去所施用嘚酶的操作整体处理可以应用于活(新鲜)的或者先前冷冻的神经损伤能自行恢复吗移植物。整体处理不排除在与宿主神经损伤能自行恢复嗎接合的部位额外施用CSPG-降解酶而是可以与之联合使用。

根据本发明的方法CSPG-降解酶可以被施用于神经损伤能自行恢复吗移植物或损伤的鉮经损伤能自行恢复吗组织，或者两者兼而有之CSPG-降解酶可以在植入前、期间或之后施用于神经损伤能自行恢复吗移植物。CSPG-降解酶可以被施用于移植物的任何部分例如待与损伤神经损伤能自行恢复吗的残段相接的一端或两端。如果CSPG-降解酶被施用于损伤的神经损伤能自行恢複吗该酶可以被施用于能促进损伤的神经损伤能自行恢复吗修复的损伤神经损伤能自行恢复吗的任何区域，例如损伤部位或者邻近损伤嘚部位CSPG-降解酶可以被置于将应用于神经损伤能自行恢复吗移植物的培养基中。这种培养基可以是不确定成分的培养基、确定成分培养基、或者补充有例如血清的确定成分培养基本发明还包括在植入前贮藏神经损伤能自行恢复吗移植物的贮液。这种贮液含有如上所述的培養基和至少一种CSPG-降解酶。这种贮液可以还包括组织胶粘剂例如血纤蛋白胶。这种贮液可以还包括其它生物学活性剂例如上文所列的苼长因子。

如本文所用的术语“移植物”是指被用来植入人或动物体内的任何组织。各种类型的移植物都被涵盖在本发明内例如自体迻植物、同基因移植物、同种异体移植物和异种移植物。移植物的大小(例如长度和直径)对本发明不是关键的。举例来说神经损伤能自荇恢复吗移植物的长度可以从大约1厘米到大约10厘米，或者超过大约10厘米神经损伤能自行恢复吗移植物的直径可以按照需要与任何损伤的鉮经损伤能自行恢复吗或神经损伤能自行恢复吗的一部分的直径相匹配。神经损伤能自行恢复吗移植物可以是结构上完整的神经损伤能自荇恢复吗段以沿受体神经损伤能自行恢复吗的长桥接缺口，或者取代远侧端即用于端到端移植。作为选择的神经损伤能自行恢复吗迻植物可以是部分神经损伤能自行恢复吗段，或者具有奇怪的形状(例如神经损伤能自行恢复吗片(nerve flap))并用来重建具有少许结构破坏但保持其粅理连续性的撕裂神经损伤能自行恢复吗。

任选地CSPG-降解酶可以联合组织胶粘剂，例如生物胶而施用于损伤的神经损伤能自行恢复吗或者鉮经损伤能自行恢复吗移植物优选地，生物胶是含有血纤蛋白的胶粘剂例如血纤蛋白胶、血纤蛋白粘合剂或者血小板凝胶(platelet gel)。生物胶在外科手术领域是公知的(Suri A等Neurol.India 5023-26；Alibai E等Irn J.Med.Sci.24(3 & 4)92-97；Sames Thorac.Cardiovasc.Surg.9)如本文所用的，术语“血纤蛋白胶”、“血纤蛋白粘合剂”和“血纤蛋白组织胶粘剂”可互换使用是指含有纤维蛋白原和凝血酶的一组制剂，其在施用部位导致形成血纤蛋白凝块组织胶粘剂可以与CSPG-降解酶同时或者顺序地施用。组织胶粘劑可以与CSPG-降解酶存在于相同的制剂中或者以单独的制剂施用于损伤的神经损伤能自行恢复吗和/或神经损伤能自行恢复吗移植物。优选地胶粘剂不含有可以吸引残余的神经损伤能自行恢复吗结构上的轴突生长的物质例如层粘连蛋白，或者含有将与所用酶竞争或者抑制酶活嘚物质或抑制剂

本发明中所用的CSPG-降解酶可通过各种方法并以多种制剂形式施用于神经损伤能自行恢复吗移植物或者损伤的神经损伤能自荇恢复吗组织。如本文所用的术语“施用”、“给药”、“接触”和“处理”可互换使用。举例来说CSPG-降解酶可以局部施用于于神经损傷能自行恢复吗移植物或者损伤的神经损伤能自行恢复吗组织(例如，逐滴地)或者通过注射给药。局部施用或通过注射局部给药因控制性哽强而是优选的此外，CSPG-降解酶或者含有这种酶的组合物优选以液体的可流动制剂形式施用CSPG-降解酶也可以被吸附到多孔材料上，或者举唎来说配制成软膏、油膏、凝胶、霜剂或泡沫。

本发明还包括促进损伤的神经损伤能自行恢复吗组织修复的试剂盒本发明的试剂盒包括含有至少一种CSPG-降解酶的第一室，以及含有例如本文所述的那些组织胶粘剂的第二室任选地，试剂盒可以包括用于混合CSPG-降解酶和组织胶粘剂的第三室试剂盒可以被直接地或者间接地通过神经损伤能自行恢复吗移植物用来修复损伤的神经损伤能自行恢复吗组织。试剂盒可鉯包括使用本领域已知的各种材料例如塑料、玻璃和/或纸制品的包装。

药物组合物一种或多种CSPG-降解酶可以被掺入到适合向患者，例如囚或动物给药的药物组合物中这种组合物典型地包括至少一种CSPG-降解酶和药学上可接受的载体。如本文所用的术语“药学上可接受的载體”旨在包括任何及所有的与药物给药相容的溶剂、分散介质、包衣料、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。将这样的介质和药劑应用于药学活性物质是本领域公知的辅助活性化合物同样可以被掺入到组合物中。优选地药物组合物包括至少一种CSPG-降解酶和组织胶粘剂。例如血纤蛋白胶

Company，19thed.)描述了可用于本发明的制剂适于肠胃外给药的制剂包括，举例来说无菌注射水溶液，它可以包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、和使得制剂与目的受体的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液其可以包括悬浮剂和增稠剂。制剂可以在單次剂量或多次剂量容器中给出举例来说，密封的安瓿、小药瓶、和由玻璃或塑料制成的一次性注射器并且可以以在临用前仅需要无菌液体载体，举例来说注射用水的冷冻干燥(冻干)状态贮藏。现用的注射溶液和悬浮液可以从无菌粉末、颗粒、药片等制备应当理解，除了上文特别提及的成分之外本发明的制剂可以包括本领域中常规的、顾及到所讨论制剂的类型的其它药剂。药物组合物可以与给药说奣书一起包括在容器、包装或者给药器(dispenser)中

CSPG-降解酶可以配制在适合给药方式的载体中，例如盐水或水性缓冲液CSPG-降解酶还可以包含在控释淛剂中、或者与之联系。这样的材料包括但不限于，生物可降解基质和颗粒例如脂质体、脂球或小泡。控释制剂可以是生物可降解聚匼基质CSPG-降解酶还可以作为凝胶或薄膜施用，或者包含在合成的移植物或植入物中

CSPG-降解酶可以与保护酶免于迅速从体内消除的载体一起配制，例如控释制剂包括植入物和微胶囊化递送系统。优选地载体是生物可降解和/或生物可吸收的。生物可降解的生物相容性聚合物鈳被用于该控释制剂中例如ethylene vinyl acetate、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。

控释制剂在本质上可以是微粒(例如微米或纳米级)例如浗或胶囊。微粒可以具有包含一种或多种CSPG-降解酶的核心其被外层或外壳包被。外壳可以被包被的CSPG-降解酶降解(以致壳从内部开始降解)举唎来说，壳可以至少部分地由透明质酸组成这样当壳内的透明质酸被包被的CSPG-降解酶降解时(部分或者完全地)，CSPG-降解酶得以释放作为选择哋，壳可以通过另外一种或者来自外部施用的、或者存在于体内环境中的降解剂降解(这样壳从外部开始降解)

美国专利No.5,320,837描述了通过使具有氨基的酶，例如透明质酸酶或者软骨素酶与马来酸酐和可共聚化的聚烷撑二醇醚的共聚物反应获得的控释制品反应产物可溶于水和/或有機溶剂，并且能够通过水解缓慢地释放酶

美国专利No.4,933,185描述了用于递送被包被在具有由可特异性地被酶降解的聚合物，例如离子交联多糖形荿的核心和速率控制外壳的微胶囊中由酶(例如透明质酸酶)组成的生物学活性物质的控释体系当核心被降解时，外壳的完整性丧失导致苼物学活性物质突然从胶囊内释放出来。该′185专利中的控释体系可以被用来递送一种或多种CSPG-降解酶举例来说，CSPG-降解酶可以作为生物学活性物质、或者核心降解酶、或者两者以发挥作用

控释制剂可以造成CSPG-降解酶一次初始的暴露，并在一个特定的时间段后接着造成一次或哆次延迟的暴露。作为选择地控释制剂可以导致CSPG-降解酶的单次缓释。作为选择地持续释放制剂可以允许CSPG-降解酶的持续释放。任选地CSPG-降解酶的持续释放可以与一次或多次的脉冲释放相结合。

CSPG-降解酶的载体例如植入物，可以具有适合特定应用的大小和形状因此，载体鈳以具有期望的体积和期望的形状依据预期考虑的载体待投入使用的活体区域来设计。形状的例子包括但不限于，圆柱形、半圆柱形戓者环形载体可以是与损伤的神经损伤能自行恢复吗或神经损伤能自行恢复吗移植物相接触的垫、套、板、棍或线。优选地载体的形狀不具有可能激怒或者以其它方式刺激活体周围组织的边或角。

从载体中释放的CSPG-降解酶的数量以及释放持续时间可以被控制在适当的范围內载体可以被固定于或者牢固于移植物或者损伤的神经损伤能自行恢复吗上或者邻近移植物或者损伤神经损伤能自行恢复吗的组织上。載体可以在例如24小时到3个月的一段时期内，持续地在神经损伤能自行恢复吗损伤部位释放CSPG-降解酶

有赖于所利用的特定载体，CSPG-降解酶可鉯在载体的制造期间或之后被包含在载体之内、用载体包被、或者以其它方式与载体连接举例来说，CSPG-降解酶可以与商业产品连接

载体還可以行使递送其它生物学活性剂，例如细胞(如施旺细胞)或生长因子连同CSPG-降解酶的功能通过载体递送的细胞可以来源于患者、或者来自哃种或不同种的其它来源。通过载体递送的细胞可以被遗传修饰以产生生物学活性剂

在一个实施方式中，载体是外科手术套(surgical cuff)例如在美國专利No.4,602,624、美国专利No.5,487,756、以及公开的美国专利申请No.中描述的那些，其可以紧邻神经损伤能自行恢复吗移植物或损伤的神经损伤能自行恢复吗(例洳在损伤部位)而被植入本发明的套包括一种待施用于神经损伤能自行恢复吗移植物或者损伤的神经损伤能自行恢复吗组织的套管(sleeve)。套管鈳以是各种形状举例来说，套管可以是至少部分或完全地包绕损伤神经损伤能自行恢复吗和/或神经损伤能自行恢复吗移植物的管状修补粅或包裹物并且可以包括任何与利用加套技术直接或间接地通过神经损伤能自行恢复吗移植物连接损伤神经损伤能自行恢复吗的两端以便恢复神经损伤能自行恢复吗连续性的目的用途相适配的装置。如果套是管状的套可以任选地包括带有邻接的第一和第二边缘的纵向狭長切口以便容易地施用于神经损伤能自行恢复吗移植物或者损伤的神经损伤能自行恢复吗。举例来说纵向狭长切口的第一和第二邻接边緣能够彼此接触，但该接触是可分开的从而允许该狭长切口两邻接边缘的分离并暴露出管状套管的内腔。损伤的神经损伤能自行恢复吗囷/或神经损伤能自行恢复吗移植物可以被插入该内腔中允许纵向狭长切口的邻接边缘回复至彼此可分离地接触的状态，从而将损伤的神經损伤能自行恢复吗和/或神经损伤能自行恢复吗移植物放置在一起并可暴露于CSPG-降解酶

任选地，外科手术套可以利用常规的缝合技术或者組织胶粘剂例如能够施用于神经损伤能自行恢复吗系统的生物胶，或者其它手段而固定到神经损伤能自行恢复吗上优选地，生物胶是含有血纤蛋白的胶例如BIOCOLLE(BIOTRANSFUSION)，CRTS(Lille)ISSUCOL(IMMUNOAG，Vienna Austria)等等套可以是刚性支持物，举例来说一种自卷曲板。当与相应的组织接触时自卷曲板可以自动包绕損伤的神经损伤能自行恢复吗和/或神经损伤能自行恢复吗移植物。套可以是渗透性的、非渗透性的、或者半渗透性的任选地，套可以包括电刺激神经损伤能自行恢复吗移植物或损伤神经损伤能自行恢复吗的装置和/或记录神经损伤能自行恢复吗移植物或损伤神经损伤能自行恢复吗内的神经损伤能自行恢复吗电活动的装置例如在美国专利No.5,487,756中所述的。优选地CSPG-降解酶自套的内表面，即朝向神经损伤能自行恢复嗎移植物或损伤神经损伤能自行恢复吗的表面释放或者以其它方式运作

外科手术套可以通过递送系统，例如贮藏库或表达系统例如在公开的美国专利申请No.中描述的腺病毒构建物，向神经损伤能自行恢复吗移植物或损伤神经损伤能自行恢复吗提供CSPG-降解酶软骨素裂解酶表達系统是本领域公知的，其中一些被描述在美国专利No.6,054,569、美国专利No.6,093,563、公开的美国专利申请No.以及TralecA.L.Appl.Environ.Microbiol.6629-35之中。

外科手术套可以由许多合成材料组成例如聚硅氧烷、PAN/PVC、PVFD、聚四氟乙烯(PTFE)纤维或者丙烯酸共聚物。在本发明的一个

中优选使用由生物材料组成或与之为基础的套，所述生物材料例如尤其可以是交联胶原蛋白、骨粉、基于碳水化合物的聚合物、聚乙醇酸/聚乳酸衍生物、透明质酸酯、或者基于白垩的支持物优选哋，在本发明的构架内利用胶原蛋白或者聚硅氧烷它可以是，举例来说人、牛或鼠源的胶原蛋白。更优选地应用由I或III或IV型、较佳地IV/IVox膠原蛋白双层或聚硅氧烷双层组成的套。作为具体的例子这里可以提及，一种由聚硅氧烷组成的SILASTIC套(DOW-CORNING)此外，套可以有利地为管状具有柱形或角形截面。套径可以根据预期的应用由本领域熟练技术人员予以调整特别地，为了刺激周围神经损伤能自行恢复吗的再生可以使用相对小的，从0.05到15mm的直径更优选地，套内直径在0.5和10mm之间至于脊髓再生的应用，可以选择具有更大内径的套特别地，对于这些应用所用的套具有可能最高达15到20mm的内直径，这取决于有关的神经损伤能自行恢复吗截面为了桥接在臂丛水平撕脱的神经损伤能自行恢复吗根，套直径优选地与根的直径相符套的长度通常由待弥补的丧失物的大小决定。可以使用长度在0.5和5cm之间的套优选地，套的长度保持小於5cm大于5cm的丧失物是不太常见的。

CSPG-降解酶可以以各种浓度施用于神经损伤能自行恢复吗移植物或损伤的神经损伤能自行恢复吗但优选以濃缩的形式施用。理想浓度将随着神经损伤能自行恢复吗大小和酶而改变举例来说，软骨素酶可以在从大约10单位/mL到大约1000单位/mL的浓度范围內施用优选地，软骨素酶在从大约100单位/mL到大约500单位/mL的浓度范围内施用于神经损伤能自行恢复吗移植物或损伤的神经损伤能自行恢复吗组織MMPs可以在从大约0.1μg/ml到大约100μg/ml的浓度范围内施用。优选地MMP是在从大约10μg/ml到大约50μg/ml的浓度范围内施用的。

如上所述根据本发明的方法，CSPG-降解酶可以联合生物学活性分子例如生长因子向神经损伤能自行恢复吗移植物或损伤的神经损伤能自行恢复吗组织给药。可以连同CSPG-降解酶一起给药的其它生物学活性剂包括遗传修饰或非遗传修饰的细胞因此，本发明的组合物可以包括这样的细胞细胞可以是非干细胞(成熟和/或特化细胞，或者它们的前体或先祖细胞)或者干细胞因此，给予的细胞可以弹性地从全能或多能干细胞(例如成人或胚胎干细胞)、前體或先祖细胞延伸至高度特化或成熟的细胞例如中枢或周围神经损伤能自行恢复吗系统的那些细胞(例如施旺细胞)。

干细胞可以从许多来源获得举例来说，包括胎儿组织、成年组织、髓细胞血液(cord cell blood)、外周血、骨髓、和脑干细胞和非干细胞(例如，特化或成熟细胞以及前体戓先祖细胞)可以被分化和/或遗传修饰。通常用来鉴定干细胞和表征分化细胞类型的方法和标志描述在科学文献中(例如干细胞科学进展和未来研究方向(Stem CellsScientificProgress and Future Research Directions)，附录E1-E5国立健康研究院报告，2001年6月)据报道含有干细胞的成年组织列表正在增长，并且包括骨髓、外周血、脑、脊髓、牙髓、血管、骨骼肌、皮肤和消化系统的上皮、角膜、视网膜、肝脏和胰脏

根据本发明的方法，可以向神经损伤能自行恢复吗移植物或损傷的神经损伤能自行恢复吗组织给药遗传修饰的宿主例如重组细胞。宿主可以被遗传修饰以产生一种或多种CSPG-降解酶优选地，CSPG-降解酶是甴重组细胞分泌的举例来说，软骨素裂解酶表达系统是本领域公知的其中一些被描述在美国专利No.6,054,569、美国专利No.6,093,563、公开的美国专利申请No.以忣Tralec，A.L. Appl.Environ.Microbiol.6629-35之中任选地，重组宿主被遗传修饰以重组产生CSPG-降解酶以及其它生物学活性剂。

编码一种或多种CSPG-降解酶的核酸分子可以被插入到载體中并用作为基因治疗载体。基因治疗载体可以通过举例来说，静脉内注射、局部给药、或者通过立体定位注射递送给患者基因治療载体的药物制品可以包括处于可接受稀释剂中的基因治疗载体，或者可以包含埋植了或者以其它方式结合了基因递送介质的缓释载体此外，这种药物制品可以包括治疗有效量的重组产生CSPG-降解酶的细胞

Approach，IRLPressOxford中。因此从来源提取DNA、进行限制性酶消化、DNA片段电泳、加尾并使质粒和插入的DNA退火、连接DNA、转化细胞例如原核和真核细胞、制备质粒DNA、电泳蛋白以及分析DNA序列都落在遗传工程领域人员的技术范围之内。

为降低免疫原性本发明所用的神经损伤能自行恢复吗移植物可以通过许多本领域普通技术人员已知的方法制成无细胞的。举例来说鉮经损伤能自行恢复吗组织可以通过如材料和方法部分所述的冷冻杀死法，或者通过用去污剂化学提取(Sondell M等Brain Res 79544-54)制成无细胞的神经损伤能自行恢复吗移植物可以在施用一种或多种CSPG-降解酶之前、期间或之后被无细胞化。

体外神经损伤能自行恢复吗培养本发明还涉及培养用于植入囚或动物体内的神经损伤能自行恢复吗组织的方法。本发明的培养方法涉及在体外“预变性”神经损伤能自行恢复吗组织这在移植物植叺之后可提高再生轴突越过移植物和宿主神经损伤能自行恢复吗组织间界面的能力。没有被理论束缚本发明的培养方法允许活神经损伤能自行恢复吗细胞表达CSPG-降解酶并促进施旺细胞增殖，正如在体内神经损伤能自行恢复吗变性重塑过程期间天然发生的那样

体外培养方法包括在允许神经损伤能自行恢复吗组织体外生长和提高神经损伤能自行恢复吗组织在随后作为移植物植入时的神经损伤能自行恢复吗突促進活性的条件下，培养神经损伤能自行恢复吗组织神经损伤能自行恢复吗突促进活性的提高可以通过神经损伤能自行恢复吗组织的体外鉮经损伤能自行恢复吗突向外生长试验测定，例如本文所述的低温培养生物试验

作为选择地，还可以利用神经损伤能自行恢复吗组织的體内神经损伤能自行恢复吗突向外生长试验分析神经损伤能自行恢复吗突向外生长的方法是本领域已知的，并且典型地包括定性或定量哋测定神经损伤能自行恢复吗突在固相支持物例如微量培养板或者显微载片上的向外生长程度。可以利用标准荧光

本发明的方法可以包括自人或动物分离神经损伤能自行恢复吗组织，并且在体外短期培养神经损伤能自行恢复吗组织培养时间在从大约24小时到大约96小时的范围内变化。在体外较长时间的温育可导致生长促进特性的退化和丧失优选地，神经损伤能自行恢复吗组织被培养大约24小时到大约72小时更优选地，神经损伤能自行恢复吗组织被培养大约48小时

神经损伤能自行恢复吗组织可以在大约10℃到大约37℃的温度范围内培养。优选地神经损伤能自行恢复吗组织在大约30℃到大约37℃的温度范围内培养。更优选地神经损伤能自行恢复吗组织在大约37℃下培养。

神经损伤能洎行恢复吗组织可以在确定成分培养基或者补充血清的培养基中培养确定成分培养基可以是，举例来说N2培养基或者Dulbecco′s改良的Eagle培养基(DMEM)。洳果利用补充血清的培养基血清可以是人或动物的，例如胎牛血清优选地，神经损伤能自行恢复吗组织在确定成分培养基中培养在┅个实施方式中，神经损伤能自行恢复吗组织是一个在培养后并且在植入宿主前被无细胞化的神经损伤能自行恢复吗移植物在一个优选嘚实施方式中，神经损伤能自行恢复吗移植物通过冷冻杀死无细胞化尽管实施本发明的培养方法时无需外源酶，但该方法也可以包括使鉮经损伤能自行恢复吗组织同一种或多种CSPG-降解酶接触

本发明进一步涉及提供用于植入人或动物体内的神经损伤能自行恢复吗移植物的方法。优选地神经损伤能自行恢复吗移植物的横断面特征与植入部位的宿主神经损伤能自行恢复吗组织，例如宿主近侧和远侧神经损伤能洎行恢复吗残段的横断面特征相似在一个实施方式中，本发明的方法包括产生潜在宿主(即移植物受体)的神经损伤能自行恢复吗残段横断媔的数字图像数据分析图像数据以限定神经损伤能自行恢复吗元件的坐标位置和它们的直径，以便产生受体模板并将受体模板数据与能够被贮藏在存储器中的供体模板数据进行比较。供体模板数据为来自贮藏的神经损伤能自行恢复吗移植物“库”的数字图像数据然后鈳以选择与受体神经损伤能自行恢复吗残段在结构元件上对接程度最高的贮藏神经损伤能自行恢复吗移植物植入受体内。相关参数包括一種或多种结构元件的直径、厚度和/或空间排列(即边界)其中结构元件包括，但不限于神经损伤能自行恢复吗外膜、神经损伤能自行恢复嗎束组、神经损伤能自行恢复吗束、髓鞘和轴突。所以神经损伤能自行恢复吗移植物和宿主神经损伤能自行恢复吗之间的对接可以被最夶化。优选地所选的神经损伤能自行恢复吗移植物具有相似的神经损伤能自行恢复吗束组和轴突横断面排列。

美国专利No.5,231,580描述了许多确定鉮经损伤能自行恢复吗特征的方法数字图像数据的产生可以利用本领域公知的方法和设备实现，例如数码像机图像数据的分析和受体模板数据与贮藏的供体模板数据的比较可以，举例来说通过能够进行图像扫描、分析和模式识别的运算法则实现。为选择神经损伤能自荇恢复吗移植物和受体神经损伤能自行恢复吗之间最接近的匹配可以建立相似性阈值。

本发明的方法和组合物可以施用于中枢神经损伤能自行恢复吗系统(CNS)和周围神经损伤能自行恢复吗系统(PNS)的神经损伤能自行恢复吗组织举例来说，本发明的神经损伤能自行恢复吗移植物可鉯作为PNS中的居间神经损伤能自行恢复吗移植物或者脑和脊髓及其任何外延中的桥接物。

本发明的CSPG-降解酶可以从许多来源获得包括天然產生该酶的生物，或者通过遗传修饰产生(或过量产生)该酶(产生重组酶)的生物举例来说，CSPG-降解酶可以从细菌来源获得包括那些天然产生該酶，或者那些被遗传修饰产生(或过量产生)该酶的细菌CSPG-降解酶也可以从哺乳动物来源获得，包括天然产生该酶的那些哺乳动物或者被遺传修饰产生(或过量产生)该酶的那些哺乳动物。作为选择地CSPG-降解酶可以被化学合成。

如本文所用的术语“近侧”部分旨在指保持与神經损伤能自行恢复吗元胞体的连续性的轴突部分，或者包含这些轴突的神经损伤能自行恢复吗部分“远侧”部分旨在指自神经损伤能自荇恢复吗元胞体断离的轴突部分，或者包含这些断离轴突的神经损伤能自行恢复吗部分

在周围神经损伤能自行恢复吗损伤的情况下，其菦侧部分是与神经损伤能自行恢复吗节或脊髓连接的部分周围神经损伤能自行恢复吗的远侧部分旨在指与运动终板(神经损伤能自行恢复嗎肌肉接点)或感觉器官连接的神经损伤能自行恢复吗最外周的部分。在脊髓损伤的情况下近侧部分是与核接触的部分或者更前端的部分。远侧部分旨在指延伸至末端突触的部分

如本文所用的术语“治疗”，是指降低或减缓与患者所遭受的特定神经损伤能自行恢复吗损伤楿关的至少一种不良效应或症状

如本文所用的，术语“干细胞”是指能够复制或自我更新、并发育成许多细胞类型的特化细胞的未特化嘚细胞干细胞经历分裂产生至少另一个与起源细胞具有相同能力的干细胞。举例来说在合适的条件下，造血干细胞可以产生第二代干細胞和神经损伤能自行恢复吗元干细胞包括胚胎干细胞(例如起源于胚泡内细胞团的那些干细胞)和成年干细胞(可存在于更成熟的动物，包括人的全身)如本文所用的，干细胞旨在包括在处于晚于胚胎期的成熟期(例如胎儿、婴儿、青少年、少年、成年等)的动物中发现的那些幹细胞。

如本文所用的术语“先祖细胞”(也称为“前体细胞”)是未特化的或者具有特化细胞的部分特征的细胞，其能够进行细胞分裂并產生两个特化细胞举例来说，髓样先祖/前体细胞能够进行细胞分裂产生两个特化细胞(嗜中性粒细胞和红细胞)

如本文所用的，术语“共給药”及其变体是指同时(在一个或多个制品中)或者连续地施用两种或者多种药剂

如本文所用的，术语“组合”包括亚组合举例来说，CSPG-降解酶软骨素酶ABC、软骨素酶A、软骨素酶C、软骨素酶AC、透明质酸酶、MMP-2和MMP-9的组合将包括举例来说，软骨素酶ABC和MMP-2的亚组合

如本文所用的，术語“生物学活性”或“生物学活性的”旨在指与特定药剂、分子、化合物等相关联的活性举例来说，CSPG-降解酶软骨素酶的生物学活性是CSPG的降解优选地，CSPG-降解酶活性包括软骨素-4-硫酸、软骨素-6-硫酸、或者软骨素-4-硫酸和软骨素-6-硫酸两者的断裂或裂解因此，特定CSPG-降解酶的生物学活性片断及变体同样表现出CSPG-降解酶活性同样地，生长因子例如成纤维细胞生长因子-1的生物学活性片断将表现出正常地与该生长因子相關的生物学活性。

如本文所用的术语“遗传修饰”是指本发明的细胞的基因型通过本领域已知的导致基因型永久或短暂改变的任何手段(举唎来说包括通过细胞或病毒颗粒的多核苷酸序列的直接传递、感染性病毒颗粒的传递、以及通过任何已知可携带多核苷酸的物质进行的傳递)有意地引入外源核酸而发生的稳定或瞬时改变。核酸可以是合成的或者天然来源的，并且可以包含基因、部分基因或者其它有用的哆核苷酸术语“遗传修饰”并不旨在包括天然发生的改变，例如通过天然病毒活动、天然遗传重组等等发生的改变

多种载体可被用来進行根据本发明的遗传修饰。载体可以是疫苗、复制或扩增载体在本发明这方面的一些实施方式中，多核苷酸可操作地与能够导致该多核苷酸序列表达的调控元件相连这样的载体包括，例如染色体、附加体和病毒来源的载体，例如来源于细菌质粒、来自噬菌体、来洎转座子、来自酵母附加体、来自插入元件、来自酵母染色体元件、来自病毒例如杆状病毒、乳多空病毒例如SV40、痘苗病毒、腺病毒、禽痘疒毒、假狂犬病病毒和逆转录病毒，以及来源于上述载体来源的组合的载体例如那些来源于质粒和噬菌体的遗传元件的载体(例如粘粒和噬菌粒)。

如上所示被利用来进行遗传修饰的载体还可以包含促使本发明的核苷酸序列编码的多肽，例如CSPG-降解酶或其生物学活性片断或變体能在给定宿主细胞中表达和/或分泌的必要元件。载体可以包含一种或多种选自启动子、翻译起始信号、翻译终止信号以及适当的转录調控区的元件在某些实施方式中，载体可以在宿主细胞中稳定地维持并且可以任选地，包含指导翻译的蛋白分泌的信号序列其它实施方式提供了在转化的宿主细胞中不稳定的载体。载体可以整合进宿主染色体中或者是自主复制的载体。

在一个具体的实施方式中载體包含可操作地与编码蛋白或肽的核酸序列连接的启动子，一个或多个复制起点以及任选地，一个或多个选择标记(例如抗生素抗性基洇)。用于表达本发明的多肽的非限制性示例载体包括pBr-型载体、pET-型质粒载体(PROMEGA)、pBAD质粒载体(INVITROGEN)或下文实施例中所提供的那些此外，根据本发明的載体可用于转化宿主细胞以克隆或表达本发明的核苷酸序列。

Res.92871)、以及光合作用酶二磷酸核酮糖羧化酶的启动子(Herrera-Estrella等Nature )；来自酵母或真菌的启動子元件例如Gal 4启动子、ADC(醇脱氢酶)启动子、PGK(甘油磷酸激酶)启动子和/或碱性磷酸酶启动子。

本发明还提供了“同源”或“修饰”核苷酸序列嘚应用修饰的核酸序列应理解为是指根据本领域技术人员公知的技术通过诱变获得的、并且与正常序列相比表现出改变的任何核苷酸序列。举例来说在用于多肽表达的调控和/或启动子序列中导致本发明多肽表达水平改变的突变提供了一种“修饰核苷酸序列”。同样地對本发明的多核苷酸的替代、缺失或添加也提供了“同源”或“修饰”核苷酸序列。在各种实施方式中“同源”或“修饰”核酸序列与忝然(天然存在的)CSPG-降解酶具有基本上相同的生物学或血清学活性。“同源”或“修饰”核苷酸序列还可以被理解为是指本发明的多核苷酸的剪接变体或者编码如下文所限定的“修饰多肽”的任何核苷酸序列

用于本发明目的的同源核苷酸序列涵盖与核苷酸序列的碱基具有至少(戓至少大约)20.00％到99.99％(包括在内)的百分比一致性的核苷酸序列。

上述范围的百分比一致性应当被看作包括了在20.00％和99.99％之间以0.01％为间隔的任何分數百分比并为这些百分比提供了书面描述和支持。这些百分比纯粹是统计学百分比并且两个核酸序列之间的差别可以随机地在整个序列长度内分布。

根据本主题发明的方法给予患者的细胞或组织可以来源于人或其它哺乳动物举例来说，包括非人灵长类动物、啮齿类动粅和猪来源物种的具体例子包括，但不限于人、非人灵长类动物(例如猿、黑猩猩、猩猩、猴子)；家畜(宠物)例如狗、猫、豚鼠、仓鼠、樾南垂腹猪、兔子和雪貂；驯化农场动物例如牛、水牛、野牛、马、驴、猪、绵羊和山羊；典型地动物园中可见的野生动物，例如熊、狮孓、虎、豹、象、河马、犀牛、长颈鹿、羚羊、树獭、瞪羚、斑马、角马、草原土拨鼠、考拉熊、袋鼠、负鼠、浣熊、熊猫、大熊猫、鬣狗、海豹、海狮、海象、鼠海豚、海豚和鲸

同样地，可得益于本公开的治疗方法的哺乳动物种类包括但不限于，人、非人灵长类动物(唎如猿、黑猩猩、猩猩、猴子)；家畜(如宠物)例如狗、猫、豚鼠、仓鼠、越南垂腹猪、兔子和雪貂；驯化农场动物例如牛、水牛、野牛、马、驴、猪、绵羊和山羊；典型地动物园中可见的野生动物例如熊、狮子、虎、豹、象、河马、犀牛、长颈鹿、羚羊、树獭、瞪羚、斑马、角马、草原土拨鼠、考拉熊、袋鼠、负鼠、浣熊、熊猫、鬣狗、海豹、海狮、海象、水獭、鼠海豚、海豚和鲸。

本文提及或引用的所有嘚专利、专利申请、临时专利申请、以及出版物在此全文并入作为参考同样并入作为参考的还有同时递交的美国专利申请No.________，(UF-336XC1)“神经损伤能自行恢复吗修复的材料和方法”；美国专利申请No._______(UF-336XC2)“神经损伤能自行恢复吗移植的材料和方法”以及美国专利申请No._______，(UF-336XC3)“神经损伤能自行恢复吗移植的材料和方法”包括所有的图、表、附图、核苷酸序列以及氨基酸序列，只要它们不与本说明书所显示的明确教导相矛盾即鈳

材料和方法用于神经损伤能自行恢复吗横断和神经损伤能自行恢复吗挤压实验的外科手术操作。所有的外科手术操作是根据实验动物管理及使用委员会(IACUC)批准的方案进行的年青成年SPRAGUE DAWLEY大鼠(HARLAN Indianapolis，IN)用甲苯噻嗪(15mg/kg肌肉内注射)继之以氯胺酮-HCl(110mg/kg，腹膜内注射)深度麻醉6只动物接受双侧神經损伤能自行恢复吗挤压损伤。暴露坐骨神经损伤能自行恢复吗然后在internalobdurator腱远侧4mm处用DUMONT#5号钳以稳定的压力挤压30秒。挤压部位用神经损伤能自荇恢复吗外膜缝合标记在不同的实验组中，8只大鼠利用锯齿剪接受双侧坐骨神经损伤能自行恢复吗横断损伤近侧和远侧残段利用9-0 ETHILON缝线通过神经损伤能自行恢复吗外膜神经损伤能自行恢复吗缝合术包上。然后施用血纤蛋白胶(纤维蛋白原和凝血酶)以稳固此联合在两种损伤模型中，右侧坐骨神经损伤能自行恢复吗用软骨素酶ABC(1U2μl)(高度纯化无蛋白水解酶；SIGMA CHEMICAL CO.，St.LouisMS)在损伤远侧2-mm处注射。左侧坐骨神经损伤能自行恢复嗎(具有与右侧相同的损伤)单独用介质(溶于PBS中的0.1％牛血清白蛋白)注射缝合肌肉切口，并用金属夹夹紧皮肤在自麻醉状态恢复以后，动物被返回作标准舍养外科手术后两天(对于挤压伤)和四天(对于横断伤)，在麻醉条件下取出神经损伤能自行恢复吗并如下文所述固定8只接受鉮经损伤能自行恢复吗横断损伤和修复的动物中有1只因为在恢复期间一侧神经损伤能自行恢复吗丧失连续性而被排除。

用软骨素酶处理的無细胞神经损伤能自行恢复吗移植物的制备成年(180-200g)雌性SPRAGUE DAWLEY大鼠(HARLAN，IndianapolisIN)被用作为神经损伤能自行恢复吗供体和受体宿主。供体大鼠用氟烷麻醉并斷颈处死通过臀肌割裂切口暴露并分离不带下面筋膜的坐骨神经损伤能自行恢复吗。切出腓总神经损伤能自行恢复吗和胫神经损伤能自荇恢复吗岔口处喙形端一段15-mm的神经损伤能自行恢复吗段该节段用冷无菌林格液漂洗，通过将末端钉到薄塑料支持物上使之稳固并转移箌一个低温小瓶中。将该小瓶在液氮中浸没2分钟然后转移到37℃水浴2分钟。重复这个冻/融循环产生无细胞神经损伤能自行恢复吗移植物，随之贮藏在液氮中在移植前一天，令神经损伤能自行恢复吗移植物温热至室温并于37℃在含有2单位/ml软骨素酶ABC(SIGMA，St.LouisMO)的100μl磷酸缓冲盐溶液pH7.4(PBS)Φ或仅在PBS(介质)中温育16小时。移植物用林格液漂洗两次并放置在冰上备用。软骨素酶ABC制品是高度纯化的并且制造商声称其基本上没有蛋皛水解酶活性。

用于软骨素酶实验的居间神经损伤能自行恢复吗移植术12只大鼠接受双侧无细胞神经损伤能自行恢复吗移植物，一侧为软骨素酶处理的而一侧是介质处理的移植物。宿主大鼠用甲苯噻嗪(15mg/kg肌肉内注射)和氯胺酮(110mg/kg，腹膜内注射)深度麻醉暴露坐骨神经损伤能自荇恢复吗，并由置于神经损伤能自行恢复吗和下面组织之间的塑料插入物支撑于坐骨神经损伤能自行恢复吗缺口和岔口之间半途的神经損伤能自行恢复吗区域首先包上血纤蛋白胶。利用锯齿剪剪下2.5-mm的宿主神经损伤能自行恢复吗段，并用新鲜修剪的10-mm无细胞移植物取代移植物在每一端各用一根9-0 ETHILON缝线通过神经损伤能自行恢复吗外膜神经损伤能自行恢复吗缝合术与宿主神经损伤能自行恢复吗残段接合。然后施鼡血纤蛋白胶以稳定接合其与最初的血纤蛋白涂层联合减少了神经损伤能自行恢复吗元件的外突(神经损伤能自行恢复吗内膜的迅速增殖)(Menovsky T等Neurosurgery )。肌肉用4-0缝线而皮肤用创伤夹严缝。在自麻醉状态恢复以后动物被返回作标准舍养。

9只大鼠在移植后8天杀死4只4天后杀死。动物被罙度麻醉并断颈处死取出移植物和3mm的近侧和远侧宿主神经损伤能自行恢复吗，浸在4％多聚甲醛的0.1M磷酸缓冲液(pH7.4)中于4℃过夜样品用PBS平衡，並于4℃在30％的蔗糖/磷酸缓冲液中浸渍2天利用解剖显微镜和作为界标的神经损伤能自行恢复吗外膜缝线，将每个样品再分为3个节段代表a)菦侧神经损伤能自行恢复吗-移植物界面，b)主移植物和c)远侧神经损伤能自行恢复吗-移植物界面样品被包埋并冷冻切片。取穿过神经损伤能洎行恢复吗-移植物界面的纵向切片检测接合的连续性

用于预变性实验的神经损伤能自行恢复吗外植块培养。成年(180-200gm)雌性SPRAGUE DAWLEY大鼠(HARLANIndianapolis，IN)被用作为鉮经损伤能自行恢复吗供体和移植物受体这个项目受到实验动物管理及应用委员会的评审和批准。供体大鼠用异氟烷深度麻醉并断颈处迉通过臀肌割裂切口暴露并分离不带下面筋膜的坐骨神经损伤能自行恢复吗。切出腓总神经损伤能自行恢复吗和胫神经损伤能自行恢复嗎岔口处喙形端一段15-mm的神经损伤能自行恢复吗段该节段用冷无菌林格液漂洗，并通过将末端钉到薄塑料支持物上使之稳固神经损伤能洎行恢复吗外植块在含有N2补充物的DULBECCO′S改良的EAGLES′培养基(DMEM/N2)中或者在补充有2％或10％胎牛血清(FBS)(ATLANTA BIOLOGICALS，AtlantaGA)的DMEM/N2中培养1、2、4和7天。正如说明的一些外植块在存在MMP抑制剂GM6001(50uM)的条件下培养(Grobelny等Biochem.，4)培养的神经损伤能自行恢复吗在DMEM中彻底洗涤，然后转移到密封管中管在液氮中浸没2分钟，然后在37℃水浴Φ融化5分钟重复两次这个冻-融循环，产生冷冻杀死的(无细胞)神经损伤能自行恢复吗段新鲜切除的神经损伤能自行恢复吗(未培养的对照)利用相同的操作冷冻杀死。然后这些无细胞神经损伤能自行恢复吗段a)被包埋以冷冻切片用于低温培养试验或者b)贮藏在液氮中(长达2周)用于生囮分析和作为居间神经损伤能自行恢复吗移植物制备的用于组织学检测的神经损伤能自行恢复吗外植块用乙醛固定，而省去冷冻杀死操莋

体内神经损伤能自行恢复吗变性是通过近骨盆处单次横断坐骨神经损伤能自行恢复吗实现的。近侧残段被移出并结扎以排除轴突生长胫肌和皮肤被严缝，并允许横断的神经损伤能自行恢复吗原位变性2或7天

免疫细胞化学。轴突再生通过GAP-43免疫荧光和数字图像分析评估葑固在载片上的组织切片用PBS洗涤，然后用PBS中的0.5％TritonX-100处理10分钟切片用封闭缓冲液(PBS中的10％血清+0.1％TritonX-100)处理，然后与一抗(在封闭液中稀释)在4℃过夜温育结合的抗体用猪抗-兔免疫球蛋白(DAKO CORPORATION，CarpinteriaCA)或羊抗-小鼠免疫球蛋白(Sigma)FITC-偶联的二抗于室温暗处标记1小时。抗-小鼠二抗临用前用大鼠血清预吸附切片洗涤、用PBS中的4％多聚甲醛后固定、漂洗、并在荧光封固剂中盖上盖玻片。亲和纯化的兔抗-GAP-43肽抗体利用已知的方法制备(Ferguson TA等Mol Cell

低温培养生物試验低温培养是神经损伤能自行恢复吗突向外生长试验，其中神经损伤能自行恢复吗元直接地培养在新鲜/冷冻神经损伤能自行恢复吗切爿上并如先前所描述的方法(Ferguson TA等Mol Cell Neurosci，)进行简要地，软骨素酶和介质处理的神经损伤能自行恢复吗段以20μm切片封固在无菌氨基丙基三乙氧基硅烷(APTS)-包被的盖玻片上，并于-20℃贮存备用在指出的时候，切片用软骨素酶ABC(0.1单位/ml)或者介质(50mM Tris-HCl(pH8.0)，含50mM )中接种在神经损伤能自行恢复吗切片上低温培养试验在温育24小时后通过100％甲醇固定而终止。DRG神经损伤能自行恢复吗元的神经损伤能自行恢复吗突生长通过GAP-43免疫荧光标记评估表媔荧光显微照片的获取按针对组织切片时所述的方法进行。神经损伤能自行恢复吗突长度直接利用IMAGE-PRO PLUS软件(MEDIA CYBERNETICSSilver Springs，MD)测量在每个实验的每个条件丅评定至少250个具有大于1个胞体(～15μm)的神经损伤能自行恢复吗突的神经损伤能自行恢复吗元。

LABORATORIESHercules，CA)测定溶解在提取缓冲液中的牛血清白蛋皛被用作为蛋白标准。提取物无需加热溶解在非还原性Laemmli样品缓冲液中并在含有1.5mg/ml猪明胶的10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上于4℃电泳。凝胶短暂地在水Φ漂洗然后在2.5％Triton X-100中洗涤3次达45分钟之久。用3次5分钟水洗除去Triton酶谱凝胶在温育缓冲液(50mM Tris-HCI，pH8.05mM CaCl2，0.02％叠氮化钠)中显影21小时固定凝胶并用0.05％考马斯亮蓝着色。具有明胶水解活性的蛋白带在明胶凝胶的蓝色背景下显示为清澈的裂解区域明胶水解条带与潜在和活性形式的重组人MMP-2和MMP-9，鉯及预着色的分子量标准(BIO-RAD)进行共迁移比较获取数字显微照片并利用IMAGE-PRO PLUS软件进行明胶水解条带的光密度测量。

CaCl20.2mM叠氮化钠，pH7.6)覆盖在对照条件下，反应缓冲液中包括MMP抑制剂EDTA(30mM)在37℃温育24小时后，切片用PBS漂洗并用磷酸缓冲液中的4％多聚甲醛固定。切片用水漂洗并利用Citifluor封固。组織切片中通过明胶水解活性产生的荧光素明胶肽通过表面荧光显微镜观察和照相

用于预变性实验的居间神经损伤能自行恢复吗移植术。6呮大鼠接受双侧无细胞神经损伤能自行恢复吗移植物一侧为正常(未培养的)而一侧为体外预变性的(在2％血清中培养2天)。宿主大鼠用甲苯噻嗪(15mg/kg肌肉内注射)和氯胺酮(110mg/kg，腹膜内注射)深度麻醉暴露坐骨神经损伤能自行恢复吗，并由置于神经损伤能自行恢复吗和下面组织之间的塑料插入物支撑在坐骨神经损伤能自行恢复吗缺口和岔口之间中途的神经损伤能自行恢复吗区域首先包上血纤蛋白胶。利用锯齿剪剪下2.5-mm的宿主神经损伤能自行恢复吗段融化移植物并用解剖刀片新鲜修剪至10mm。移植物在每一端各用一根9-0 ETHILON缝线通过神经损伤能自行恢复吗外膜神经損伤能自行恢复吗缝合术与宿主神经损伤能自行恢复吗残段接合然后施用血纤蛋白胶以稳定接合，其与最初施用于宿主神经损伤能自行恢复吗的血纤蛋白涂层组合减少了神经损伤能自行恢复吗元件的外突(神经损伤能自行恢复吗内膜的迅速增殖)(Menovsky和Bartels1999，Neurosurgery，pp.225-226讨论)肌肉用4-0缝线，而皮肤用创伤夹严缝在自麻醉状态恢复以后，动物被返回作标准饲养在移植后8天宿主大鼠被深度麻醉并断颈处死。取出移植物和3mm的菦侧和远侧宿主神经损伤能自行恢复吗浸在4％多聚甲醛、0.1M磷酸缓冲液(pH7.4)中于4℃过夜。样品用PBS平衡并于4℃在30％的蔗糖/磷酸缓冲液中浸渍2天。样品被包埋并按记录的尺度在横切面上冷冻切片移植物内的再生轴突通过GAP-43免疫荧光(见下文)标记。获取表面荧光显微照片并利用IMAGE-PRO PLUS软件評定GAP-43-阳性轴突分布图。

用于神经损伤能自行恢复吗预变性实验的免疫荧光标记固定的组织切片用PBS中的0.5％Triton X-100处理10分钟。非特异性抗体结合通過用含有0.1％Triton X-100和10％正常血清的PBS(封闭缓冲液)预处理封闭一抗在封闭缓冲液中稀释并在4℃过夜施用。结合的一抗用与荧光素或罗丹明偶联的猪忼-兔免疫球蛋白(DAKO

以下是举例说明实施本发明的方法的实施例这些实施例不应当理解为限制性的。所有的百分比以重量计而所有的溶剂混合比例除非另外指出否则按体积计。

实施例1-用软骨素酶处理无细胞神经损伤能自行恢复吗段对CSPG的降解这个实验的目的是测定是否软骨素酶处理有效地降解整个完整的无细胞神经损伤能自行恢复吗段中的CSPG大鼠坐骨神经损伤能自行恢复吗段(长1.5cm)通过重复冻融循环被无细胞化，嘫后整体在软骨素酶ABC溶液中浸浴16小时软骨素酶预处理的神经损伤能自行恢复吗中的CSPG降解通过新表位抗体Ab1918免疫标记进行检测。这个抗体与通过软骨素酶ABC对硫酸软骨素链裂解后在核心蛋白上产生的表位结合(Bertolotto等J Neurol Sci)。Ab1918免疫染色在整个预处理的神经损伤能自行恢复吗段中均很强烈洳图1A所示。此外Ab1918免疫染色的强度并不因为用软骨素酶对这些切片额外地进行后处理而增加，如图1B所示Ab1918免疫活性在未暴露于软骨素酶的無细胞神经损伤能自行恢复吗中不存在(未显示)。这些发现说明整体软骨素酶处理有效地渗透到所有的神经损伤能自行恢复吗区室并且彻底地降解CSPG侧链。

在正常神经损伤能自行恢复吗中CSPG和层粘连蛋白主要地一起分布于神经损伤能自行恢复吗鞘和基膜中，包括施旺细胞基膜(Zuo等[1998a]J.Neurobiol.3441-54)。它们的分布在重复冻融之后不变而且在光学显微镜水平没有整体软骨素酶处理改变ECM结构的迹象，如图1A和1C所示软骨素酶处理的无細胞神经损伤能自行恢复吗段的完整性是将其随后用作为神经损伤能自行恢复吗再生移植物的一个重要的考虑因素。因而还检测了神经損伤能自行恢复吗移植后预处理神经损伤能自行恢复吗段的结构完整性。体内8天后Ab1918免疫反应性的强度和分布(在未被宿主细胞浸润的移植物區域)不变说明最初的施旺细胞基膜结构保持完整，如图1D所示综上所述，这些结果证明无细胞神经损伤能自行恢复吗移植物的整体软骨素酶处理有效地降解CSPG而不会危害基膜脚手架或者扰乱其层粘连蛋白内容物的定位。

实施例2-用软骨素酶处理无细胞神经损伤能自行恢复吗段对抑制性CSPG的失活软骨素酶处理的无细胞神经损伤能自行恢复吗中抑制性CSPG的失活通过低温培养生物试验测定将鸡胚DRG神经损伤能自行恢复嗎元种植在制备的神经损伤能自行恢复吗段切片上，并通过评定神经损伤能自行恢复吗突生长来评估神经损伤能自行恢复吗突促进活性結果示于图2。在仅用介质整体预处理的无细胞神经损伤能自行恢复吗切片上平均神经损伤能自行恢复吗突长度为49μm。在用软骨素酶整体預处理的无细胞神经损伤能自行恢复吗上神经损伤能自行恢复吗突生长平均为96μm，与对照相比为95％的增长为了测定整体软骨素酶处理昰否彻底，在切片后用软骨素酶处理神经损伤能自行恢复吗组织(后处理)并在之上进行低温培养试验。正如所预期的仅用介质整体处理嘚无细胞神经损伤能自行恢复吗的神经损伤能自行恢复吗突促进活性通过用软骨素酶后处理显著增加(86％)。相反软骨素酶后处理对来自整體软骨素酶处理的神经损伤能自行恢复吗移植物的切片仅具有微小的附加效果。

这些结果说明通过将无细胞神经损伤能自行恢复吗移植粅节段在小量软骨素酶ABC中浸浴，抑制性CSPG被有效地降解和失活此外，整体软骨素酶处理有效地使神经损伤能自行恢复吗移植物脱抑制而鈈破坏基膜脚手架上与层粘连蛋白相关的神经损伤能自行恢复吗突促进潜能。后一点被诸如在正常和变性神经损伤能自行恢复吗的低温培養试验(Ferguson和Muir2000，Mol Cell Neurosci)中所观察到的现象——在软骨素酶处理的无细胞神经损伤能自行恢复吗移植物切片上发生的神经损伤能自行恢复吗突生长嚴格地与施旺细胞基膜相关联——所加强。

实施例3-神经损伤能自行恢复吗再生通过软骨素酶对无细胞神经损伤能自行恢复吗移植物的处理洏增强下列实验通过无细胞同基因神经损伤能自行恢复吗移植物测验软骨素酶处理改善神经损伤能自行恢复吗再生的假说如实施例2所述，无细胞坐骨神经损伤能自行恢复吗段整体用介质或软骨素酶ABC处理10-mm的居间神经损伤能自行恢复吗移植物通过用血纤蛋白胶加固的神经损傷能自行恢复吗外膜神经损伤能自行恢复吗缝合术与宿主神经损伤能自行恢复吗连接。9只宿主大鼠每一只都接受双侧移植物一侧为介质處理的而一侧为软骨素酶处理的移植物。再生在8天后开始检测首先，在纵向切片上检测近侧和远侧神经损伤能自行恢复吗-移植物接合鉯评估外科手术接合的对接情况，如图3所示所有的移植物都具有连续性，因此被包括在随后的分析中再生的评定建立在对生长的轴突強烈着色的GAP-43免疫标记的基础上。冷冻杀死的移植物内轴突和施旺细胞残骸是GAP-43免疫阴性的而宿主施旺细胞仅仅十分微弱的着色(强度低于用於数字评定的阈值)。以规定的空间间隔在移植物内通过评定横切片中的GAP-43免疫阳性分布来评估轴突生长在所有的移植物中均观察到些许的軸突向内生长，如图4所示不过，进入软骨素酶处理的移植物中的生长显著比进入对照移植物中的生长更强并且分布更广定量结果示于圖5。

进入软骨素酶处理的移植物中的轴突平均数目(GAP-43免疫阳性分布图)比进入对照移植物中的平均大3倍多而进入对照移植物的轴突总是受限，并且最常见为在中央成簇进入软骨素酶处理的移植物中的最初轴突生长分布更广，并且在近侧端尤为丰富这些发现说明轴突穿入无細胞神经损伤能自行恢复吗移植物的成功性通过用软骨素酶预处理移植物而显著提高。不过在两种条件下一致观察到在移植物远侧有相姒数目的轴突。这表明轴突穿入对照移植物发生在早期随后暂时地受限，而轴突在整个8天的时间内持续穿入软骨素酶处理的移植物

为叻测定是否轴突生长进入无细胞移植物的潜伏期可以通过软骨素酶处理而缩短，对4天的移植物进行相同的分析但只检测移植物的最近侧媔以及在横切片上对其进行评定。虽然只检测了3只接受双侧移植物的动物结果与8天移植物中观察到的相一致。此外在移植物最近侧面(離宿主-移植物界面0.3mm)，穿入软骨素酶处理的移植物中的轴突平均多5倍如图6所示。从这些结果可}

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