神经干细胞及其研究进展
神经干细胞及其研究进展
神经干细胞(neural stem cell,
NSC)是指分布于神经系统的、具有自我更新和多分化潜能的干细胞。其主要功能是作为一种后备贮备，参与神经系统损伤修复或细胞正常死亡的更新。20世纪最后十几年来神经生物学领域内最重要的进展之一，就是发现了成年脑组织内确实存在有多能干细胞（即神经干细胞不仅存在于胚胎时期，也存在于成年动物的中枢神经系统，它们有着类似于皮肤和造血系统内干细胞的功能）。巢蛋白（nestin）是目前作为识别神经干细胞的重要标志蛋白，巢蛋白阳性细胞具有干细胞的特征。
今天，科学家普遍相信，无论是胚胎还是成年脑内都有可分裂的干细胞，它们能够生成更多的神经干细胞包括神经祖细胞（progenitor）和神经元及胶质前体细胞（precusor），神经前体细胞再分化成各类神经元；而胶质前体细胞则分化成星形胶质细胞和少突胶质细胞。在正常情况下，神经前体细胞不会演变成为胶质细胞，胶质前体细胞也不会演变成神经元。然而，存在于胚胎或成年中枢神经系统内的干细胞，在特定信号和脑组织三维环境作用下，却可以发育成神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞。由于神经干细胞可望成为补充因损伤、衰老而丧失的神经元或胶质细胞、提供一种替代来源，致使该领域的研究如雨后春笋，倍受关注。
一、成年脑的神经干细胞
研究首先从纹状体培养出干细胞样的中枢神经系统的多潜能细胞，它们来自室下带；类似的细胞也来自其他成年还可能生成神经元的区域——海马齿状回；此外，有些曾被认为是不可能在成年再生成神经元的地方，包括脊髓、隔区和纹状体的实质及小脑大脑皮层也分离出了多潜能的干细胞。成年的少突胶质前体细胞首先从培养视神经获得，后又从中枢神经系统其它部位中分离出来，如小脑和脊髓。小脑表明，干细胞在成年中枢神经系统的广泛区域都存在。最近还发现，成人脑内也存在神经元前体细胞。
研究发现，成年脑虽具有生成新神经元的可能，但主要限于海马齿状回和嗅球。由于在这两个区域产生的是新神经元，所以它们必然是来自有限的神经元祖细胞而非多潜能的干细胞。齿状回产生的祖细胞，在成年动物中就位于齿状回内部；而产生嗅球颗粒细胞核团周围神经元（periglomerular
neurins）的成年祖细胞，则位于侧脑室最前部位的室管膜（subependyma）内，靠一种神经细胞粘合分子（neural cell
adhesion molecules, N-CAMs）丝裂原，神经诱向因子等的作用，迁移到嗅球。
构成成年脑组织的神经元和胶质细胞均来自神经管直接衍生的胚胎神经上皮细胞。这些细胞位于胚胎脑室腔的表面，组成脑室带（ventricular
zone）；随着胚胎发育，室带中的某些细胞深入脑组织，组成室下带（subventricular
zone），到了成年就形成了室管膜细胞。研究证明，室管膜细胞与神经球细胞有关；成年前脑的室管膜至少含有两种细胞：持续增殖的细胞和相对静息状态的细胞，后者还有可能是前者的补充；有人认为，静息状态的室管膜细胞更可能是在体外培养下形成呈集落状的神经干细胞，说明体内的相对静息的室管膜细胞与体外培养、形成小球的神经干细胞是一回事。
生长因子能够在体外使神经干细胞繁殖形成集落，在体研究（脑室注射神经生长因子）也证明生长因子除能使成年室管膜细胞数量扩大外，还可使新生成的室管膜细胞从侧脑室壁迁移到邻近部位（如皮质、纹状体和隔区）的软脑膜上。提示加入外源性生长因子对使用胚胎脑组织细胞或基因工程细胞移植治疗脑损伤具有重要意义。
二、胚胎神经干细胞
（一）胚胎神经干细胞的来源及发育模式
中枢神经系统的神经干细胞来源于囊胚期的内细胞群，至少分两类，即神经上皮干细胞和神经球干细胞，前者依赖成纤维生长因子(fibroblast
growth factor，FGF)发育分化，后者依赖表皮生长因子（epidermal growth
factor，EGF）发育分化。因此有学者也将神经系统的两类干细胞分别称为FGF依赖神经上皮（Neuroepithilia，NEP）细胞和EGF依赖神经球干细胞。1992年，Reynolds首先报导神经球干细胞的存在，之后在猴、猪、狗、人、小鼠的各个脑区均发现有神经球干细胞；这些细胞依赖EGF而发育；有自我更新能力和产生神经元、少突胶质细胞及星形细胞的多分化潜能。另一类存在于CNS的干细胞是FGF依赖神经干细胞，它同样具有自我更新和多向分化的能力。两类干细胞均可进一步分化过渡形成多种中间型限制性前体细胞，包括：限制性神经前体细胞（neuroal-restricted
precusors, NRPs），限制性胶质前体细胞(glia-restricted precusors,
GRPs)，少突胶质细胞2型星型细胞（oligodentrocyte-type 2 astrocytes,
O2AS），星形胶质前体细胞（astrocyte precusor cells,
APCs）以及周围神经系统的前体细胞即神经嵴干细胞（neural crest stern cells,
NCSCs）。尔后，各类限制性前体细胞分别形成相应的靶细胞群。
（二）神经干细胞发育的时限性
胚胎神经干细胞主要来源于胚胎E10期左右的单层神经上皮，这些上皮细胞就是祖细胞。脑的神经干细胞源于胚胎E10的祖细胞的皮质神经上皮；它们分化为两种细胞：成神经细胞或成胶质细胞。以后，成神经细胞于胚胎期分化形成神经元，而胶质细胞在胎儿生后才分化完成。即神经元和胶质细胞发育有明显的时间分隔特性。神经干细胞于胚胎12天开始出现，15天达高峰，以后逐渐终止分化，至出生时基本完成。而胶质发生的高峰出现在神经发生基本完成之后。Jacobson的报导也证实神经元发生在胚胎期，而胶质细胞发生在出生以后（如大脑皮的星形胶质细胞在E16可首先被探测到，而少突胶质细胞呈现在出生时，但大量的胶质细胞主要被产生于生后的头一月）。他们认为这种时空分隔可能有利于神经网络的形成（如神经元可在胶质细胞之前得到充分分化形成较长的突起。以后胶质细胞再充填于神经网络之间）。
至于什么因素造成神经和胶质细胞的分化尚不清楚。有人推测，早期发育神经细胞产生的成纤维细胞生长因子2（fibroblast
growth factor 2,
FGF2）可能在促进神经元和胶质细胞分化过程中起重要作用。现已清楚,在体外培养的神经干细胞内添加如睫状神经营养因子(ciliary
neurotrophic factor, CNTF)，FGF2，血小板源性生长因子( platelet-derived
neurotrophic factor, PDGF)，骨形态相关蛋白（BMPs）可促进胶质细胞发育。
三、 神经干细胞的特性及表面特征
由于体外证实神经上皮干细胞依赖FGF发育分化，而神经球干细胞依赖EGF发育分化，因此，CNS神经干细胞从开始可能就有不同的发育特性。继而形成相应的各类前体细胞，从而决定了最终的分化方向和所要形成的靶细胞。两类神经干细胞各具特性如下表示：
EGF依赖神经球细胞&&FGF依赖神经上皮干细胞
生长方式&&悬浮式生长&&贴壁生长或悬浮生长
发生时间&&出现在胚胎发育后期（E14，5天后，小鼠）&&出现在胚胎发育中期（大鼠E10，5，小鼠E8，5）
依赖生长因子&&依赖EGF发育&&依赖FGF发育
表达受体&&表达EGFR&&不表达EGFR
分布&&脑区，在脊髓无EGF依赖神经球出现，发育期&&整个发育期脊髓均有FGF依赖干细胞
产生细胞&&不产生神经嵴和PNS细胞&&产生PNS和神经嵴细胞
分化速率&&慢&&快
此外，各类限制性前体细胞还具不同的表面抗原特性。
四、 神经干细胞的分布与定位
最近才证实，胚胎脑内的干细胞的确可以形成全部脑内神经元和星形、少突胶质细胞。哺乳动物胚胎脑中的神经干细胞主要位于七个部位：嗅球、侧脑室脑室带（室管膜上皮）、脑室下带、海马、脊髓、小脑（后脑的一部分）和大脑皮质。在不同物种之间，上述部位细胞的形态和数量颇有不同。人们认为，位于不同部位的神经干细胞可能属于不同干细胞的群体，而非同一类干细胞分布在不同位置。因此，脑的正常发育过程不仅取决于这些胚胎神经干细胞的增殖和分化，还决定于这些细胞中哪些会经受程序性死亡或凋亡。
现已证实，在脑和脊髓有限制性神经前体细胞分布，这些干细胞主要分布于海马、纹状体、脑室下区，嗅球、以及发育中的大脑皮质、脊髓及小脑皮质外颗粒层。
迄今为止，在成年啮齿动物的中枢神经系统中，比较明确的有三组干细胞（已经有初步证明，人脑内的情况也基本如是）：①位于邻近脑室的脑组织内，称为脑室带（ventricular
zone）。脑室带中室管膜上皮细胞本身就可能含有神经干细胞。室管膜上皮细胞衬在脑室壁的表面，具有纤毛，过去一直认为它不会分裂，功能与血脑屏障有关。近来有一些研究证明它们具有干细胞的特性。此外，在室管膜上皮细胞层的深层即是室管膜下带或脑室下带（subventricular
zone），此带细胞混杂，包括：神经母细胞（尚未成熟的神经元，可以迁移到嗅球）、前体细胞和星形胶质细胞。这一邻近脑室的脑组织在胚胎发育时期是细胞积极分裂的神经组织生发部位，到了成年时期，该部位体积大大缩小，但仍含有干细胞；②连接侧脑室和嗅球的条带区域又称喙嘴侧流（但此区在人类未获证实）。在啮齿类，侧脑室的干细胞不断向嗅球迁移，使感受嗅觉信息的嗅球神经元不断得到更新，更新的途径就经过这个条带区域；③海马（人和鼠海马干细胞的部位都是在齿状回的颗粒下层）。海马与记忆形成的功能有关。
FGF依赖干细胞的分布主要在脊髓（从发生看，脊髓的神经干细胞主要源于神经管腹侧假复层神经上皮，之后，这些细胞从中央管向外线膜扩展至远端），这些神经干细胞表达神经上皮（neural
epithelium,
NEP）所特有的标志物——巢蛋白或巢素(nestin)，但不表达其它与分化有关的标志物。以后NEP干细胞按照特异的时空程序、发育分化为神经元，少突胶质细胞和星形胶质细胞。在脑则主要是EGF依赖神经干细胞，但同时也有少量FGF依赖神经干细胞。在中脑和皮质，两类干细胞共存。
五、 神经干细胞分化的调控
众多的研究表明，神经干细胞的分化由内源性因素（基因）和外源性因素（细胞因子）的相互作用调控。
（一） 内源性因素（基因）
研究表明，在脊椎动物体内，有与果蝇achaete-scute复合体（as-c）和atonal（ato）功能相近的基因，这些基因编码产生碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）转录子，称为bHLH基因，是决定神经细胞分化命运的功能基因。在bHLH基因家族中，与as-c功能相近的基因Neurogenin
1（Ngn1）、Neurogenin
2（Ngn2）和与ato功能相近的基因MASH-1的功能在中枢和外周神经系统神经细胞谱系的调控决定中具有重要作用。在发育的哺乳动物大脑皮质，两个密切相关的bHLH基因（Ngn1和Ngn2）仅表达于皮质脑室带这一神经上皮前体细胞的存在部位，并仅在神经发生时期表达。Ngn1和Ngn2均与普遍存在的bHLH蛋白（如E12和E47）形成二聚体，然后此杂二聚体通过碱性区域与带正电的DNA序列结合，启动组织特异基因表达，促使干细胞向神经元方向分化。
Ngn1在促进向神经元分化的同时抑制干细胞向胶质细胞分化。这一作用通过两种机制：①将CBP/p300/Smad1复合体与胶质启动子隔绝；②抑制Jak/STAT信号通路。即使在有诱导向胶质细胞分化的因子存在的环境中，Ngn1仍可抑制细胞因子诱导的皮质前体细胞和干细胞向胶质细胞分化，并诱导向神经元分化。Ngn2
和MASH-1对不同的干细胞起作用，在促进向神经元分化的同时，抑制干细胞向胶质细胞分化，Ngn2在皮质前体细胞中的表达出现在细胞从高增殖、多分化能力的前体细胞向限制性的前体细胞（神经元性和胶质性）这一特定阶段。MASH-1的诱导与干细胞的初始分化同时发生，MASH-1的强烈表达导致nestin下调和Prox-1上调，从而正性调控细胞分化。与Ngn2相比，MASH-1的表达使干细胞更倾向于向神经元前体细胞分化。MASH-1缺失导致神经上皮细胞增殖减少，神经元分化标志Tuj-1表达减少。Ngn2和MASH-1的功能有互相补偿的作用，单一的Ngn2或MASH-1基因缺失对大脑皮质发育影响不大，但两基因均缺失可导致皮质发育不良（皮质板层变薄）。总之，bHLH基因亚类主要调节神经元及胶质细胞命运的选择，错误表达后，可使分化的神经元减少，但对胶质分化无影响。
另一控制神经干细胞分化命运的通路为Notch信号，Notch基因编码（300KD）的单向传递的跨膜受体，该受体蛋白的细胞外区域含有36个前后排列的表皮生长因子（EGF）样重复序列和3个富含半胱氨酸的Notch/LIN-12重复序列，在胞内区有6个前后排列的锚蛋白重复序列，1个富含谷氨酰胺的区域（opa），和1个PEST序列。Notch蛋白通过两种类型细胞间作用起局部调控功能：即所谓的侧方抑制信号和诱导性信号。Notch蛋白的胞内区（RAMIC）与一种DNA结合蛋白——RBP-J相作用、引起一系列蛋白水解，使信号由RAMIC传至胞核发挥调控作用。与bHLH信号作用相反，Notch蛋白的作用为抑制干细胞向神经元方向分化，同时促进向胶质方向分化。
也有研究表明，Notch的激活抑制少突胶质前体细胞（OA）分化发育为少突胶质细胞，并且抑制神经上皮细胞向神经元分化。在神经发生之前向小鼠前脑导入Notch-1（NTC），发现转染NTC的细胞变成放射状胶质细胞，提示Notch的激活在抑制向神经元分化的同时，可促进体内皮质干细胞向放射状分布的胶质细胞分化。在出生后，许多转染NTC的细胞变成脑室周围的星形细胞（一种存在于成年中枢神经系统的干细胞）。而正常表达于分化神经母细胞的Notch配体，可抑制神经巢干细胞的神经元产生，这一作用强于BMP－2的诱导作用：与预期的相反，即使一短暂的Notch激活，就足以引起神经巢干细胞神经发生能力的不可逆丧失，并伴以加速的胶质分化，而不是使它们维持未分化状态或促进它们自我更新。激活的Notch1和Notch3可促使成年大鼠海马的多能前体细胞（AHPs）分化为星形胶质，而且Notch信号的作用为指令性的，短暂的Notch激活可促使AHPs不可逆地转向星形胶质分化。Notch信号的星形胶质诱导机制不依赖STAT3通路（通过形成STAT3-Smad1复合体介导），这与LIF、CNTF和BMP2不同。
（二） 外源性因素（细胞因子）
1．生长因子
利用发育的小鼠端脑中的神经干细胞、进行体外培养神经球分析来研究神经干细胞增殖，发现，FGF反应性神经干细胞早在E8.5时就出现在前神经板，而EGF反应性干细胞在发育时出现较晚，并以特定的时空方式表达（FGF与EGF反应性干细胞为不同的干细胞群）。FGF反应性干细胞在E11至E14时期通过对称分裂增殖，但在E14和E17期间转向原始的不对称分裂、且细胞周期延长。EGF反应性干细胞在E11后增加，是通过自身对称分裂和FGF反应性干细胞不对称分裂产生的，外源性BMP-4可模拟幼年皮质细胞抑制EGF反应性细胞发育的作用，而FGF-2可对抗BMP-4的作用。EGF反应性神经干细胞较多分化为星形细胞，而FGF反应性干细胞则较多分化为神经元。在发育过程中，伴随着EGF受体（Receptor,
R）表达的增加，多能神经前体细胞逐渐向分化为胶质细胞命运转变。有研究表明，发育过程中的细胞向胶质分化不依赖于EGFR信号系统，因用PD158780（EGFR特异的酪氨酸激酶抑制因子）虽可阻断EGF的促细胞增殖作用，但胶质细胞分化不受影响。
两栖类再生脊髓的体内实验显示，FGF-2上调可诱导神经前体细胞增殖，而利用FGF基因缺陷小鼠的实验表明，内源性的FGF-2的合成为刺激损伤后（缺血或兴奋性）成年海马齿状核的神经前体细胞生成的充分和必要条件。
2．TGF beta超家族
暴露于BMP-2的端脑神经前体细胞可改变其分化命运，由神经元分化转向分化为星形细胞，BMPR显著减少表达神经元标记和多能神经干细胞标记（微管相关蛋白2和nestin）的细胞数，而表达星形细胞标记S100-β的细胞数增多。在体实验表明，BMP-2上调负性HLH因子Id1，Id3和Hes-5，抑制神经发生HLH转录因子MASH-1和neurogenin的转录启动。Id1或Id3的异位表达抑制神经上皮细胞的发生。BMP-2促进神经干细胞向神经元分化，其作用优于GGF2的促胶质分化作用，是通过诱导bHLH蛋白MASH-1产生起作用的。在发育的不同时期、BMP信号对前体细胞的诱导作用不同。在E13d，BMP促进室带前体细胞死亡，抑制细胞增殖；在大脑皮层发育的后胚胎时期（E16），低浓度的BMP（1-10ng/ml）促进神经细胞和星形胶质细胞增加，高浓度（100ng/ml）则促进细胞死亡，在出生前的皮质胶质细胞形成时期、BMP促进星形胶质细胞数增加，但在发育的所有时期、内源性BMP可有效抑制少突胶质细胞产生。其抑制少突胶质细胞分化，抗前体细胞增殖及促星形胶质细胞分化效应，可被另一种细胞因子（Shh）拮抗。
激活素（actin）促进星形胶质细胞分化。但多能干细胞和单能星形前体细胞对激活素的反应能力不同，单能细胞可直接被激活素诱导生成星形胶质，而多能干细胞则不能被激活素直接诱导成胶质细胞，但经LIF预处理后的多能干细胞可被激活素诱导为星形胶质细胞。
3．神经营养因子3（NT3）、脑源性神经营养因子（BDNF）
神经营养因子的主要作用主要是促进神经元存活及分化，不同的生长因子对神经细胞的分化有不同的调节作用，应用BDNF，IGF-1，BMP-2，RA并未诱导干细胞向神经元分化，而是促进NRP向胶质细胞分化。NT3刺激鸟类神经管前体细胞分化为运动神经元，但对分化的离体运动神经元的存活总数则无明显影响。NT3与FGF-2合用可促进神经巢干细胞向交感神经细胞分化。BDNF可促进EGF反应性神经干细胞向神经元分化。但是神经营养因子对细胞分化的影响似乎是通过促进已分化的神经细胞的成熟，而不是使未分化的多能干细胞向神经元分化。维甲酸可能为促进多能干细胞向神经元或星形细胞分化的起始阶段的促进因子。
第二节 神经干细胞培养的方法学进展
一、 成体组织及胚胎组织神经干细胞的培养方法
最先培养成功成年大鼠纹状体组织神经干细胞以及成年大鼠脊髓组织神经干细胞的Reynolds和Weiss所采用的培养方法基本一致：组织取材后酶解消化，然后转入含0.7
mg/ml 卵粘蛋白的DMEM/F12 (1:1)
液中机械吹散，将细胞悬液4000转/分高速冷冻离心5分钟，再将沉淀洗涤一次后用培养基悬浮细胞，调整活细胞浓度为0
个/ml，置于未包被的培养皿中培养。培养基的配方为：DMEM/F12(1:1)为基础培养基，包含5 mM
HEPES、0.6%葡萄糖、3 mM碳酸氢钠、以及 2 mM 谷氨酰胺；另加入25 &g/ml 胰岛素、100 &g/ml
转铁蛋白、20 nM孕酮、60 &M腐胺以及30 nM 亚硒酸钠代替血清；再加入人重组EGF
和/或bFGF各20ng/ml。悬浮培养在培养皿中的成年小鼠纹状体细胞大部分于2天后死亡，但有少量细胞可继续分裂、增殖，形成细胞集落球，并悬浮于培养液中。经免疫细胞化学检查，细胞球中几乎所有细胞都是nestin阳性。当这些细胞球被接种到涂有多聚左旋鸟氨酸的玻璃盖片后，细胞球贴壁后分化为神经元及胶质细胞。若在培养板底部涂敷具有抗贴壁作用的多聚2-羟乙基甲基丙烯酸酯，也能成功地分离出神经干细胞球。所以，悬浮培养是分离培养神经干细胞的前提。在培养基适合的情况下，神经干细胞可分裂增殖并维持其干细胞特性。
以上由Reynolds和Weiss所创立的“neurosphere法”一直沿用至今。但为适应目前神经干细胞实验研究的需要，许多学者发展了众多效率更高的方法。Kallos等提出接种神经干细胞的最佳PH值是7.1~7.5之间，细胞密度在105
/ml以上。 Sen等创立了一种大规模扩增神经干细胞数量的方法。他们不把神经球打散，而是将神经球的平均直径控制在150
&m左右，这样球中心的细胞就不会发生坏死。然后将神经球置于悬浮生物反应器中培养，12天内传代3次，细胞数目就扩增了近3000倍，细胞密度达到106
/ml，且活细胞比例达到80％以上。而Low等则将EGF反应性鼠神经干细胞用旋转管培养法培养3天后，细胞形成肉眼可见的三维复合物，其数量是传统固定培养瓶培养所获细胞数量的数十倍。
此外，有许多学者将“neurosphere法”加以发展，应用于鼠胚、人胚、成人以及其它哺乳动物如犬、羊等的胚胎及成体组织的神经干细胞培养，并对这些不同来源神经干细胞培养方法的差异加以探讨。Carpenter等提出分离和增殖人神经干细胞的条件是和啮齿类动物不同的，并指出了LIF对人神经干细胞增殖的重要性。他们发现在培养液中加入EGF、bFGF和LIF时，培养50天以内干细胞增殖的速度和不加LIF没有差别，但培养50天以后不加LIF的培养液中的干细胞的增殖明显缓慢下来，而加LIF的培养液中的干细胞的增殖速度每7至10天就增加一倍。另有实验研究了人胚与鼠胚神经干细胞体外培养的差异后认为：①使用单一生长因子即可从鼠胚分离神经干细胞，但不能从人胚皮层分离神经干细胞，而要协同采用具有丝裂原作用的生长因子，如bFGF和EGF，才能够从人胚皮层分离神经干细胞；②鼠胚神经干细胞的增殖能力明显高于人胚神经干细胞；③人胚神经干细胞分化为神经元的比例高于鼠胚神经干细胞。
二、 其它来源神经干细胞的培养方法
人胚胎干细胞的应用虽受限制，但仍有定向诱导胚胎干细胞向神经干细胞（NSC）转化的报道。Tropepe等将ESC置于含有成纤维细胞生长因子2（FGF
2）10ng/ml、白血病抑制因子(leukemia inhibition factor，LIF)
1000U/ml条件下低密度培养，约0.3%的细胞形成表达nestin的细胞团，证实为NSC，且在传代培养中对FGF
2和LIF具有依赖性。Fraichard等在含有1μmol/l维甲酸(retinoic acid，RA)的培养液中培养ESC
2d，第3d在单层细胞表面可鉴别出nestin阳性细胞。这些细胞在无LIF和RA的培养基中分化为星形细胞、少突胶质细胞、γ氨基丁酸(GABA)能神经元和胆碱能神经元。电生理检查发现这些细胞具有电压依赖性K
、Na 通道，并对电刺激产生冲动，说明ESC能被RA定向诱导为NSC。
此外，由于在体外状态很难维持原代神经干细胞生存或增殖达足够长的时间，以检测其特性或对外源性因子的反应，所以可通过基因转移技术得到永生化神经干细胞系，用于基因转移及神经再生方面的研究。比较经典的产生永生化神经干细胞系的方法是，用携带癌基因的逆转录病毒转导发育中的脑细胞，使得细胞停留于细胞分化的某一时期，不能进行终末分化，并获得了长期传代的能力。常用基因是myc、neu、p53、腺病毒EIA和猿猴病毒40(SV40
) large T抗原热敏突变体。通过检测large T抗原各种已知的变异情况对细胞凋亡的影响，发现large
T抗原的J结构域和Rb结合基元(Rb-binding motif)在此过程中发挥决定性作用。因此，可以将large
T抗原转导入神经干细胞中，从而使神经干细胞成为永久稳定的不死的细胞系。根据这一原理，Slinskey等应用SV40的病毒质粒载体将large
T抗原导入来源于胚鼠的神经干细胞中，发现每一个表达large
T抗原的细胞系既可以在不含EGF的培养基中进行细胞分裂，又可以使细胞克服血清的生长抑制作用，能够在含有10%胎牛血清的培养基中生长增殖，还可以有效地抵抗凋亡的发生。
第三节 体外培养神经干细胞的应用
自从神经干细胞的自身分裂增殖和多潜能分化能力被认识以后，人们就对其在中枢神经系统损伤和退行性疾病这样非常棘手的疾病中可能发挥的治疗作用充满了希望。所以，在神经干细胞体外培养成功不久，就有人将其用于脑内移植、转基因研究以及药理实验研究等。综合目前的研究成果，神经干细胞体外培养的应用主要集中在以下几个方面：①在可控制的培养条件下实现快速体外扩增，满足体内移植所需的细胞数量。②根据拟移植部位的细胞类型及细胞结构特异性，在体外使神经干细胞分化成与受者部位细胞类型与构成相似的细胞群体后再行移植。也就是说为了满足特殊部位移植的需要可事先在体外对供者细胞进行诱导，使之定向分化，从而能更容易掺入靶组织，提高移植物存活率。③利用神经干细胞或永生化神经干细胞系可实现克隆培养，能够持续分裂增殖，并能较顺利地与宿主组织整合的特点，可将其作为“治疗性基因”的载体，对损伤或病变部位施行基因治疗，以实现外源性治疗基因的准确定位、高效表达。④另外，利用神经干细胞可低温冻存，而且复苏后仍能维持原来的生物学特征这一特点，可构建各种不同类型的神经干细胞株，用于神经生理、神经药理及神经病理等基础性研究。
对于CNS损伤后功能的修复，目前尚无有效的方法。临床治疗主要是依靠其自身的修复能力，并辅之以一些神经营养药物（如脑活素、胞二磷胆碱等）及高压氧等治疗措施。但效果均不尽如人意。
上世纪90年代中期，神经科学家终于明白了成年人脑组织内也存在着“神经干细胞”，在一定条件下神经元具有再生的可能性。这样，探讨如何使用这些干细胞来取代脑组织的损伤和变性，就成了当前神经科学的研究热点。对此，研究者提出了两个研究战略。
一种战略就是用未分化的神经细胞在体外（即实验室的培养皿里）生长，将它们诱导分化为预先设计好的成熟神经细胞，再将这些分化好的细胞植入损伤的脑内，起修复作用；或将未分化的干细胞直接植入损伤脑内，靠体内的信号机制让这些未分化细胞发育成为该部脑组织所需要的成熟神经元，以达到修复目的。许多不同的干细胞均可用于这一治疗战略，包括神经先祖细胞和多能胚胎干细胞。
另一种战略是企图去发现某种生长激素和其他“营养因子”，即有助于细胞存活和生长的各种生长因子、激素和其他信号传递分子，这些物质能够激发病人自己的干细胞或修复机制，对损伤的组织进行修复。
无论是哪一种战略，目前均处于基础研究阶段，临床试验尚需慎重。随着NSCs研究的深入，发现NSCs及其转基因产物是一种非常有潜在价值的治疗手段。NSCs植入CNS后，不仅不会干扰正常组织的其它神经生物学功能，而且植入的NSCs，可望弥补有功能障碍的神经元和胶质细胞，或是以调节的方式将治疗基因的产物弥散入CNS从而在CNS损伤中发挥治疗作用。
一、 神经干细胞与脑损伤修复
目前，对发育中或成年CNS中存在神经干细胞（NSCs）的认识已较为肯定。NSCs具有自我更新能力，其对称分裂能力是其自身增殖的基础，而其不对称分裂又为其向其它细胞分化提供了可能；NSCs具有多向分化潜能，受不同诱导可以分化成神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞。这些特性使得NSCs可成为CNS损伤后修复的理想细胞替代源。此外，NSCs来源相对不受限制，也可避开社会伦理的束缚。这些都为NSCs植入CNS提供了基础。
（一） NSCs在脑损伤时参与修复活动
很多报道证实，NSCs在脑损伤时会出现一定的反应，Tzeng等将溴脱氧尿苷[(bromadeoxyuridine，BrdU)：由于BrdU是一种DNA前体物质，只能被处于分裂的细胞所摄取，因此观察BrdU标记细胞可以判断该细胞是否有分裂的可能性。]注入脑部（刺伤大鼠侧脑室上皮质）10分钟后，在病灶区可观察到小胶质细胞和巨噬细胞浸润，并出现NFκB/P65(
)细胞激活，同时注射区和对侧相应非注射区的SVZ／VZ源性神经前体细胞均出现BrdU的强标记。结果证实，双侧大脑半球SVZ／VZ源性神经前体细胞在单侧脑损伤后均会出现DNA合成，提示NSCs在脑损伤时参与修复活动。Zhang等发现，C-kitR及其配体干细胞因子(SCF)
在CNS损伤时有表达。SCF能调节大鼠小胶质细胞的功能。他们以大鼠穿透性脑外伤为模型，通过免疫组化和原位杂交来分析SCF／C-kitR表达，结果发现，伤口邻近的小胶质细胞的C-kitR表达升高。
Levine等研究发现，少突胶质前体细胞（oligodendrocyte Precursor
Cells,OPCs）除了可以提供一个少突胶质细胞库外，在脑干迷走神经背核的运动神经元、受弱毒性假狂犬病毒(PRV)感染时，尚可发生反应，表现为
OPCs立即靠近感染灶。其特点是：①胞体用NG2抗体染色加深；②病变更明显；③病灶区胞体出现丝状伪足。这些改变在早期就出现，且与运动神经元中的病毒抗原相伴出现，少数OPCs还包含有病毒抗原，提示OPCs在脑受损时会出现很强的反应，进而对脑功能产生一定的影响。&
Tada等用离子辐射方法照射大鼠脑，180天后观察到，室管膜下(SE)增殖，形成的细胞总数及其中可增殖细胞数和未成熟的神经元数均下降。且辐射剂量越大，NSCs受损越多。提示正常SE的形态结构及功能有赖于NSCs的维持，当受到照射后NSCs不能再构建SE。结果从反面证实NSCs对脑损伤修复是有益的。&
（二） 用胚胎脑细胞治疗帕金森病的研究
用胚胎脑组织细胞来治疗帕金森病的研究可以看作是先期干细胞脑内治疗作用的例证。现已知道，帕金森病是引起运动障碍的老年神经变性疾病，病变部位主要位于向纹状体投射的中脑黑质神经元，其神经递质属于多巴胺（dopamine,
DA），而DA的主要作用就是调节控制身体运动神经结构的机能。因此，在患帕金森病时，黑质神经元遭受死亡，DA合成减少，运动控制出现障碍。但目前尚不清楚黑质神经元为什么会死亡。用合成DA的药物左旋多巴来治疗帕金森病在初期疗效明显，但随着治疗时间加长，效果会逐渐减弱而副作用却日趋严重，因此靠用药不能治愈帕金森病。细胞治疗帕金森病的概念很简单，即向脑内植入细胞以取代丢失的DA能神经元。然而具体实施这个简单概念却很不简单，向脑内植入完全成熟的DA能神经元并不能在脑中存活，也不能与脑组织（如纹状体）形成网络或突触联系。在上个世纪70年代，就有试验将大鼠胚胎黑质DA神经元注入成年大鼠眼前房内，在此最终发育成为成熟的DA神经元；到80年代，瑞典人就开始将自体肾上腺髓质细胞及胚胎黑质神经元移植到帕金森病模型大鼠和猴的纹状体，使动物的运动症状得到明显的改善，还证明，这些植入的胚胎细胞能够发育成成熟的DA神经元，并与宿主脑的神经组织构成突触联系。后来将此用于临床试验，使用妊娠八周的胎儿脑的黑质植入帕金森病脑内，在有些病人身上取得了良好的疗效，并用正电子发射计算机断层扫描成像（positron
emission tomography, PET）证实，病人的脑内DA能神经元获得明显增加,
DA神经元与宿主脑组织也显示较好整合。人们后来认为，植入胚胎黑质细胞的疗效正反映了神经元前体细胞具有明显的可塑性，对神经损伤的修复有重要价值。但是，使用胎儿脑组织作为移植物毕竟来源受限制，很难实施标准化，且存在诸多伦理问题。所以，也有一些人试图使用动物（如猪）的胎脑来取代人的胎脑（如美国的Diacrin和Genzyme两家生物技术公司就使用了猪的胎脑）。但是除免疫问题外，治疗效果还不能肯定。
（三） 神经干细胞替代治疗帕金森病研究
基于上述理由，人们积极研究从干细胞培养实验室来源的细胞来用作帕金森病的治疗，即选择合适的生长因子和培养条件将干细胞培养成为DA能神经元前体细胞，再用它来进行脑内移植，使之在脑内完成最终的发育成熟；也可以将干细胞直接植入脑的损伤部位，使之在脑的微环境信号指导下，发育成合适的替代神经元。将未分化的干细胞演化成为DA能神经元或前体细胞可以通过不同途径（包括用转入某种仅在细胞发育早期表达的基因）。也有人使用囊胚内细胞团的胚胎干细胞，使之在培养基中保持未分化状态；（但使用这种细胞要注意不能有分化为其他组织如肌肉或骨骼的细胞混入其内）。还有人使用来自其他组织的干细胞（如脐带血细胞和骨髓基质细胞），它们可经过处理而被诱导成为神经细胞（但还不清楚它们能否具备完美的神经元功能）。然而无论如何，近年来已经有不少研究证明，将上述细胞植入帕金森病模型动物脑内，可以看到症状的改善、DA能神经元形成或建立新的突触联系。这些研究为使用神经干细胞治疗帕金森病提供了令人鼓舞的前景。
（四） 通过诱导自身干细胞来修复脑损伤
尽管也显示有一定治疗前景，但诱导损伤脑组织自身干细胞的战略还不如细胞替代疗法更成熟些。诱导脑组织自身干细胞可以通过向损伤脑组织引入他人胚胎或成年干细胞的办法，也可以通过给予病人药物来达到这一目的。我们已经知道，灵长类脑内的干细胞主要位于脑室下带和海马齿状回。但是在正常情况下，灵长类动物这两个地方都没有什么新生的细胞出现。直到上世纪90年代中期，人们才看到这两个部位在脑损伤情况下有生成一些细胞迁向损伤区域的现象。所以现在人们都在忙于探讨这种现象究竟能对脑的损伤修复起多大的作用。
最近的研究发现，一种在身体发育早期存在的肽类物质——转移生长因子a（transforming growth factor
TGFa）对我们身体多种器官（包括肝和皮肤）的修复机制有重要作用。研究提示在一些慢性进程的脑疾病（如帕金森病）中，基本不会出现正常的脑修复机制；如果给予足够的TGFa，就能够激发脑组织的修复功能。研究还发现，将TGFa注入健康大鼠脑内，可以引起脑室下带的干细胞增殖若干天，然后这种现象就会消失。但是，如果将TGFa注入经过6-OHDA损毁的大鼠脑内，就会发生两种情况：干细胞在脑室下带增殖数天之后，干细胞以一种“迁移波”的方式移向损伤部位并在那里分化成为DA能神经元；同时，动物不再出现运动不正常现象。这种症状改善，究竟是由于新形成了DA神经元，还是引出了其他什么营养因子，目前尚不得而知。
（五） 神经干细胞移植对缺血性脑损伤的修复作用
Kempermann等认为可塑性是脑的一个基本特性，但需多种作用基质，且受机体状态影响。正常时，神经元的可塑性仅发生在海马及嗅觉系统。但近年研究发现，即使中老年人大脑也具有可塑性，故通过干预
NSCs使之特异分化而获取神经元，以便进行脑功能的修复。
Park进行神经祖／干细胞植入低血氧(HI)性脑损伤的治疗研究。结果发现，这些细胞首先迁移至缺血区，在其中生长并表达外源性基因。植入NSCs表达的神经营养因子(NTFs)、可以促进CNS调动自身的NSCs库、进行自我修复。提示NSCs移植在HI脑损伤中可以通过表达NTFs、而促进脑修复。Abe认为，神经元和神经胶质细胞的发育及其维持是受
NTFs控制的。外源性NTFs对缺血性脑损害有保护作用，可能是通过NSCs来完成的。提示NSCs对缺血性脑损伤有治疗潜能。
在NSCs促进认知恢复方面，近年也有报道，Gray等建立了两种大鼠模型：一是将四条小血管阻塞(4VO)引起CAI海马区细胞缺血性损害；二是用毒素致前脑胆碱能投射系受损。两者均有认知缺陷。MHP3来源于E14d永生化小鼠(Embryonic
immortomouse)的海马原基，是一种条件性永生性神经干细胞克隆系。分别将它植入两种模型中，结果细胞迁移至损伤区，在4VO中重构CAI锥形层、并分化成神经元及胶质表型，促进了认知能力的恢复。在第二种模型中也出现相似的作用。提示MHP3具有多潜能多功能，对不同类型脑损伤均有修复作用。
二、 神经干细胞与脊髓损伤
应该说，帕金森病在神经系统疾病中还算是相对简单的（只涉及一个脑部位的一种细胞），而脊髓损伤后的修复就困难得多。脊髓损伤后，可累及多种类型的细胞，特别是那些联系着脑和身体其他部位的神经元。要使这些神经元能够在损伤部位生长出来，并与身体各部建立功能联系，无疑是十分困难的。但是，脊髓损伤的病人只要有一点修复就对其生活有重大意义（如部分肢体的活动、膀胱活动得以管制或疼痛能予以减轻等），而这种部分修复可能正是我们治疗的目标。在多数情况下，脊髓损伤并非全断，往往还有一些传导信息的轴突是完整的，然而这种完好的轴突、并不能传递正常的信息；因为同时还失去了少突胶质细胞，即不能给轴突披上髓鞘。因此，目前研究是设法给脊髓补充失去的少突胶质细胞。现在已经有一些实验证明，干细胞有助于使神经损伤后大鼠的神经纤维重新披上髓鞘（如可使经过化学去髓鞘后大鼠脊髓，再注入由胚胎干细胞诱导而成的少突胶质细胞可以使轴突再披髓鞘），同时动物瘫痪的肢体显示出有限度的恢复。然而，同样不能判断这种改善是由于披上髓鞘，还是由于其他营养因子所致。脊髓损伤由于轴突离断退变或脱髓鞘导致功能丧失，而急慢性脊髓损伤后亦少见轴索自发再生。因此，通过植入有产生髓鞘能力的细胞，来提高轴突及其髓鞘的再生，对于恢复脊髓的功能可谓一种有效途径。而脊髓中NSCs及其分化产物的植入可能极具治疗潜能。
Liu等提出维甲酸诱导胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells，ＥS
cells）分化成少突胶质细胞，进而产生髓鞘，可能是治疗CNS原发性或继发性脱髓鞘性疾病的有效途径。他们把ES
cells植入脱髓鞘后大鼠的脊髓，发现大量ES
cells存活、并分化成有产生髓鞘能力的成熟的少突胶质细胞。McDonald等将胎儿的CNS细胞植入急性脊髓损伤后，也发现有轴突再生。Johansson等研究还证实在脊髓损伤时，室管膜细胞可迅速增殖迁移、并分化为星形细胞。提示室管膜细胞作为神经干细胞在CNS损伤时参与其反应。
在补充脊髓损伤的细胞损失方面，可望用
NSCs直接植入，或体外分化后植入来弥补。Cao等从大鼠14天胎大脑皮质和成年大鼠SVZ分离出未分化的NSCs，用Brdu标记干细胞植入正常大鼠脊髓，2周到2月后均发现大量细胞存活；一部分分化成少突胶质细胞，大部分分化成星形细胞，但无NeuN阳性神经元。若植入成年受伤大鼠的脊髓及其周围的灰白质，2月后分化成GFAP阳性星形细胞并具nestin(
)神经元，无Brdu阳性的神经元和少突胶质细胞。提示NSCs移植后虽有存活，但只分化成神经胶质细胞。故若要将NSCs分化成神经元，则可能需在体外诱导分化。&
关于NSCs及其分化产物对脊髓损伤的修复作用报道较多。Lee等将从胚胎性癌细胞系(NT2)分化成的人神经元(NT2N)、植入免疫缺陷裸鼠脊髓后，发现，植入细胞可与宿主嵌合，存活达成15个月以上，神经元表型与宿主年龄无关，这些神经元被少突胶质细胞产生的髓鞘包裹。提示NT2N神经元植入鼠脊髓可以与宿主嵌合，且移植后能显示并维持成熟神经元的形态及分子表型，有助于提高对脊髓损伤的治疗。
McDonald等发现，将鼠和猫胎儿脊髓组织植入慢性损伤脊髓，也可出现部分功能改善。他们将鼠胚胎干细胞植入外伤9天的大鼠脊髓中，2－5周后，观察到植入细胞存活并分化为星形细胞、少突胶质细胞及神经元，并迁移了约8mm。此外，大鼠肢体功能还有部分恢复。Park等发现，多潜能神经祖细胞或干细胞能够完全与生长发育中或退变的CNS嵌合，通过增加或进一步限制条件，此细胞在基因转移及细胞移植中也同样有作用。另外，在某些神经退变中其移植也可能是唯一的途径。干细胞的这些生物学特性，为将其应用于临床治疗，特别是脊髓功能障碍的治疗提供了可能。
Whittemore等发现了一种永生性CNS源性神经元前体细胞(RN33(查看原图)
，它具有很强的可塑性，并能特异分化成与内源性神经元形态相似的神经元。成年CNS可影响其分化。Whittemore用增加脊髓细胞有丝分裂因子的方法来获得未分化的人类神经前体细胞，受表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子-2(FGF2)作用，这些细胞出现增殖分化，且具有多向潜能，可分化成神经元和星形细胞。提示这些细胞对CNS的损伤有修复作用。
但是，虽然成人CNS中确实存在有NSCs，且近年来的研究也取得了较大进展，但由于其绝对数量和局部微环境所限，致CNS损伤或变性时自我修复作用微乎其微。因而，澄清NSCs在体内大量增殖及分化的调节因素仍是开发NSCs最终临床应用的关键所在。
从事脊髓损伤修复研究的学者都说，用干细胞治疗脊髓损伤还需要大量的基础研究，但一致认为前景很好。必须看到的是，当今对这方面的研究进展迅速，用神经干细胞（无论是植入的还是被诱发的）来治愈神经损伤一定能取得惊人的成果。
三、 转基因神经干细胞及其它转基因细胞在脑及脊髓（CNS）损伤中的作用
除了NSCs可直接植入CNS外，目前NSCs的另一个研究方向是，把体外经基因修饰后，可表达特定因子的NSCs植入CNS。现已能从发育期及成年中枢神经系统中分离出干细胞，并可将这些细胞在体外培养成永生化细胞系，使之成为体外转基因载体。移植后可以将转基因产物(Transgenic
Product)在CNS损伤区大量表达，从而对那些广泛或多发性损伤发挥治疗作用。
CNS损伤后，除了神经细胞的丧失外，植入的细胞存活及分化、尚受特定环境及因子的调节。可采取在体外以逆转录病毒或腺病毒为载体，对NSCs或成纤维细胞作基因修饰，通过体外细胞转基因在体内表达相关生长因子或NTFs以达到治疗CNS损伤的目的。Liu等在体外用含Iac或绿色荧光蛋白GFP基因的重组腺病毒为载体，对原代成纤维细胞作基因修饰、并植入大鼠脊髓，该细胞存活、并表达转基因２个月以上。证明重组腺病毒载体对于CNS疾病体外基因治疗是一种有效的工具。
Liu等用含有NT-3.IRES.Iacz/neo序列的逆转录病毒对NSCs克隆(C17)作遗传修饰，使之能表达神经营养因子-3(NT-3)。然后，将细胞植入大鼠脊髓。对体外及体内的干细胞分别作了研究，结果发现：①大部分细胞均表达NT-3
和Iacz基因，且无论体外、体内均出现高度联合表达。②细胞在脊髓内可存活长达2个月以上，并分化成神经元和胶质细胞，还出现一定的迁移。结果提示转基因NSCs对脊髓损伤有修复作用。
Carpenter等人将hNGF基因导入NSCs后植入大鼠脊髓，获得NGF反应性干细胞，进而通过GFAP启动子，主导分泌hNGF。这为NGF等NTFs性转基因干细胞治疗CNS损伤提供可能。由于NTFs对损伤神经元的存活及神经突起生长有促进作用，因而NTFs性转基因NSCs移植对CNS损伤着有广阔前景。
四、 神经干细胞与脑、脊髓损伤修复研究的前景及展望
胚胎来源的神经干细胞因具有向各方面分化的功能，故将之用于因异常而致细胞丧失的疾病治疗有广阔的开发前景。此外，成年大脑NSCs的发现及具有增殖能力和分化方向的可控性、易与宿主细胞嵌合等优点，极大地鼓舞了人们想用内源性NSCs作为移植工具的积极性，这在临床治疗中极具潜力。但是不同部位，不同种类神经元的再生、分化各有其特点，需要不同调节因子的精确控制，因此，阐明不同调节因子在中枢不同部位的调节特性，将是今后NSCs研究的一项重要内容。
对CNS损伤，转基因治疗是新发展起来并极有前景的神经病学治疗战略，过去十年在神经干细胞生物学(Biology of Neural
Cell)领域取得了巨大进步，预计不久的将来，这项技术从实验室应用到临床将成为可能。而且，随着进一步研究的深入，相信人类永生化NSCs株将成为新的有前途的基因治疗载体。但目前，干细胞移植尚有许多问题待解决。包括：①获取纯化干细胞，并将其保存于体外，不进一步分化的技术尚有待于进一步完善。②干细胞植入和注入方法，需建立标准并作效果评价。③植入后如何控制免疫排斥反应，还有待进一步改善。④通过植入干细胞，同时带入目的基因不失为一种更有效、更有目的治疗损伤或疾病的方法，但如何选择及提高载体，选择提示基因表达产物并达到长久稳定的表达与宿主达到整合，减少或避免移植并发症，干细胞的跨系定向分化等，仍有待于进一步完善。
总之，随着神经分子生物学(Neuromolecular
Biology)研究的进展，传统观点受到挑战，神经元细胞的再生性研究已成为生物学研究的重要课题。随着NSCs基础理论的不断更新和发展，其应用于CNS损伤后功能恢复的研究一定会取得突破性进展。如脑瘫、脊髓横断性截瘫等临床治疗的世界性难题，也将有望得到解决。但是也要看到，NSCs研究是一门新兴的科学，人们对NSCs研究还不够深入，需要探索的方面还很多。如果这些问题得到解决，干细胞在中枢神经系统疾病治疗方面的作用定会取得突破性进展。
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