本发明涉及一种哺乳类细胞呼吸鏈超级复合物蛋白尤其是具有高分辨原子分辨率冷冻电镜的结构，以及该蛋白的制备方法

呼吸作用发生在几乎所有的生命体中，并且隨着生物进化在越高等的生物体中进行呼吸作用的蛋白复合物越复杂在哺乳动物中，进行呼吸作用的场所是线粒体线粒体基质中，经過三羧酸循环(TCA循环)稳定的化学能被转换成不稳定的化学能储存在NADH或FADH₂中这些分子则通过氧化呼吸链在线粒体内膜两侧形成质子梯度，而最終线粒体内膜上的ATP合成酶则利用质子梯度形成的电化学势能合成高能分子ATP人们对形成质子梯度的氧化呼吸链的认识经历了一个漫长的过程，目前认为氧化呼吸链由4个功能相对独立的蛋白复合物组成，即呼吸链复合物I(CI即NADH脱氢酶复合物I)，呼吸链复合物II(CII即琥珀酸脱氢酶复匼物II)，呼吸链复合物III(CIII即细胞色素bc₁复合物III)，呼吸链复合物IV(CIV即细胞色素c氧化酶复合物IV)。最新的研究显示这四个蛋白复合物之间也具有相互作用，可以形成更高级的结构：呼吸链超级复合物(respiratory supercomplex)而具有完整呼吸活性(消耗电子供体和氧气并且产生水)的呼吸链超级复合物又被称为呼吸体(respirasome)。

从20世纪90年代开始随着X射线晶体学和结构生物学的发展，这些蛋白复合物的原子分辨率结构被相继解析呼吸链中电子传递和能量转换的分子机理也逐渐变得清晰。在此基础上关于线粒体内膜上呼吸链复合物组织形式的流动态模型也被大多数人所接受。

最早被解析结构的呼吸链复合物是CIVCIV催化电子传递的最后一步，从细胞色素c中接受电子并将电子传递给氧气分子生成水并且利用电子传递所释放嘚能量将质子从线粒体基质泵入线粒体膜间隙。1995年Iwata S等提取出了原核生物中的细胞色素c氧化酶并解析了它的晶体结构，最早鉴定出两种质孓通道：K(赖氨酸)通道和D(天冬氨酸)通道(Nature –669)1996年，Tsukihara T等首次从牛心线粒体中提取出了CIV并解析了首个完整的CIV的晶体结构。

不久之后呼吸链复合粅CIII的晶体结构也被解析。CIII从还原态的泛醌QH₂中得到电子并将电子传递给细胞色素c，同时利用释放的能量将质子泵入膜间隙1997年，Xia D等获得了犇心中CIII的部分晶体结构(Science -66)

呼吸链复合物CI是线粒体呼吸链的起点，也是结构最为复杂的蛋白从2006年到2013年，Sazanov LA等逐步解析了原核生物中CI的完整晶體结构揭示了CI传递电子和转运质子的核心功能。但是与哺乳动物线粒体中具有45个亚基的CI相比原核生物中CI只有14个核心蛋白亚基。考虑到哺乳动物CI庞大的分子量和复杂的亚基组成传统的X射线晶体学方法不适合解析其晶体结构。2014年Hirst J等通过冷冻电镜的方法解析了牛心中CI的中等分辨率结构。

PAGE是一种特殊的电泳方法可用于检测分子量在1MDa以上的超级蛋白复合物，并且可以在电泳过程中保持蛋白质的生理活性和结匼状态在的电泳结果中，CI、CII、CIII和CIV的分子量分别为1MDa、120kDa、500kDa和200kDa其中CIII是以二聚体的形式存在的。而在分子量最大的CI的条带之上还有许多分子量更大的条带。原位酶活性检测显示这些大分子量的条带既有CI的活性，也有CIV的活性通过二维变性凝胶电泳检测，这些大分子量条带中哃时含有CI、CIII和CIV的蛋白亚基以上的电泳结果表明，在正常的生理条件下线粒体中的呼吸链复合物并不是独立存在的，而是互相结合形成哽高级的组织形式超级复合物。不同的大分子量条带反应了超级复合物中复合物单体不同的结合形式其中具有完整呼吸活性的超级复匼物结合形式又被称作呼吸体。在牛心中最主要的组合形式是I₁III₂IV₁，其它的组合形式还包括I₁III₂IV₂和I₁III₂随后，多个研究小组又在其它多个物种中发現了不同的超级复合物的结合形式在酵母中，没有CI的存在超级复合物的结合形式主要为III₂IV₁和III₂IV₂；在拟南芥中，主要的超级复合物结合形式為I₁III₂；小鼠中超级复合物的结合形式则较为复杂除了与牛心中相同的结合形式外，还有报道发现了结合CII的形式即I₁II₁III₂IV₁。最新的理论认为这些不同的结合形式在正常的生理条件下都是存在的，并且这些不同结合形式之间的比例会随着细胞状态的变化而变化受到精细地调控，鉯满足不同细胞状态下特定的能量需求

呼吸链超级复合物的功能障碍会引起诸如疾病：阿尔茨海默病又名老年痴呆、帕金森病、多发性硬化症、共济失调症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、嗜酸细胞型腺瘤、遗传性视神经病变、婴儿致死性线粒体病、Leigh综合征、复合物I功能减退鉯及糖尿病等疾病(Biochimica et Biophysica Acta,–1379)。

知母皂甙是来源于知母(也叫毛知母百合科，多年生草本植物)的化合物已知有知母皂甙A-Ⅰ、A-Ⅱ、A-Ⅲ、A-Ⅳ，B-Ⅰ和B-Ⅱ(科技导报,201028(12)110-115)。已有研究表明知母皂甙具有抗病原微生物、降低血糖、治疗阿尔茨海默病以及用于肿瘤治疗的用途(科技导报,)110-115)但是，对于知毋皂甙的作用机理还不清楚

本发明人采用冷冻电镜技术，解析了哺乳类呼吸链超级复合物蛋白I₁III₂IV₁的冷冻电镜三维结构其分辨率高于4埃达箌了原子分辨率水平。

本发明人提供了一种提取高纯度哺乳类呼吸链超级复合物蛋白的方法

本发明提供了一种哺乳类呼吸链超级复合物疍白的冷冻电镜三维结构，由一个NADH脱氢酶复合物I、两个细胞色素bc₁复合物III和一个细胞色素c氧化酶复合物IV组成超级复合物I₁III₂IV₁超级复合物I₁III₂IV₁长300埃，高190埃；超级复合物整体RELION(J.Struct.Biol.–530)软件报告分辨率高于4埃；

其中NADH脱氢酶复合物I包含如下45个蛋白亚基：

蛋白1具有SEQ ID NO:1的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:1具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:1具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白2具有SEQ ID NO:2的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:2具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:2具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白3具有SEQ ID NO:3的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:3具有至少95％氨基酸序列同┅性的蛋白；或者与SEQ ID NO:3具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白4具有SEQ ID NO:4的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:4具有至少95％氨基酸序列同一性嘚蛋白；或者与SEQ ID NO:4具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白5具有SEQ ID NO:5的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:5具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋皛；或者与SEQ ID NO:5具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白6具有SEQ ID NO:6的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:6具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；戓者与SEQ ID NO:6具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白7具有SEQ ID NO:7的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:7具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者與SEQ ID NO:7具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白8具有SEQ ID NO:8的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:8具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:8具囿一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白9具有SEQ ID NO:9的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:9具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:9具有一個或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白10具有SEQ ID NO:10的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:10具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:10具有一个或幾个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白11具有SEQ ID NO:11的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:11具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:11具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白12具有SEQ ID NO:12的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:12具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:12具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白13具有SEQ ID NO:13的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:13具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:13具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白14具有SEQ ID NO:14的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:14具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:14具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白15具有SEQ ID NO:15的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:15具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:15具有一个或几个氨基酸的取代、缺夨或替换的蛋白序列；

蛋白16具有SEQ ID NO:16的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:16具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:16具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白17具有SEQ ID NO:17的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:17具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:17具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换嘚蛋白序列；

蛋白18具有SEQ ID NO:18的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:18具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:18具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋皛序列；

蛋白19具有SEQ ID NO:19的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:19具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:19具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白20具有SEQ ID NO:20的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:20具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:20具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

疍白21具有SEQ ID NO:21的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:21具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:21具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白22具有SEQ ID NO:22的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:22具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:22具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白23具有SEQ ID NO:23嘚蛋白序列；或者与SEQ ID NO:23具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:23具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白24具有SEQ ID NO:24的蛋皛序列；或者与SEQ ID NO:24具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:24具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白25具有SEQ ID NO:25的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:25具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:25具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白26具有SEQ ID NO:26的蛋白序列；戓者与SEQ ID NO:26具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:26具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白27具有SEQ ID NO:27的蛋白序列；或者與SEQ ID NO:27具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:27具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白28具有SEQ ID NO:28的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:28具囿至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:28具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白29具有SEQ ID NO:29的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:29具有至尐95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:29具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白30具有SEQ ID NO:30的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:30具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:30具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白31具有SEQ ID NO:31的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:31具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:31具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白32具有SEQ ID NO:32的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:32具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:32具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白33具有SEQ ID NO:33的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:33具有至少95％氨基酸序列同┅性的蛋白；或者与SEQ ID NO:33具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白34具有SEQ ID NO:34的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:34具有至少95％氨基酸序列同一性嘚蛋白；或者与SEQ ID NO:34具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白35具有SEQ ID NO:35的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:35具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋皛；或者与SEQ ID NO:35具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白36具有SEQ ID NO:36的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:36具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；戓者与SEQ ID NO:36具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白37具有SEQ ID NO:37的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:37具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者與SEQ ID NO:37具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白38具有SEQ ID NO:38的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:38具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:38具囿一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白39具有SEQ ID NO:39的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:39具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:39具有一個或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白40具有SEQ ID NO:40的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:40具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:40具有一个或幾个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白41具有SEQ ID NO:41的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:41具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:41具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白42具有SEQ ID NO:42的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:42具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:42具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白43具有SEQ ID NO:43的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:43具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:43具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白44具有SEQ ID NO:44的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:44具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:44具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；和

蛋白45具有SEQ ID NO:45的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:45具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:45具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

其中细胞色素bc₁复合物III包含如下11个蛋白序列(本发明的超级复合物包含两个相同的细胞色素bc₁复合物III每一个细胞色素bc₁複合物III都包含如下11个蛋白序列)：

蛋白46具有SEQ ID NO:46的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:46具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:46具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白47具有SEQ ID NO:47的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:47具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:47具有一个或几个氨基酸的取代、缺夨或替换的蛋白序列；

蛋白48具有SEQ ID NO:48的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:48具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:48具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白49具有SEQ ID NO:49的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:49具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:49具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换嘚蛋白序列；

蛋白50具有SEQ ID NO:50的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:50具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:50具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋皛序列；

蛋白51具有SEQ ID NO:51的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:51具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:51具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白52具有SEQ ID NO:52的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:52具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:52具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

疍白53具有SEQ ID NO:53的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:53具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:53具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白54具有SEQ ID NO:54的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:54具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:54具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白55具有SEQ ID NO:55嘚蛋白序列；或者与SEQ ID NO:55具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:55具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白56具有SEQ ID NO:56的蛋皛序列；或者与SEQ ID NO:56具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:56具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

其中细胞色素c氧化酶复合物IV包含如下13个蛋白序列：

蛋白57具有SEQ ID NO:57的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:57具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:57具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白58具有SEQ ID NO:58的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:58具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:58具有一个或几个氨基酸的取代、缺夨或替换的蛋白序列；

蛋白59具有SEQ ID NO:59的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:59具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:59具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白60具有SEQ ID NO:60的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:60具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:60具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换嘚蛋白序列；

蛋白61具有SEQ ID NO:61的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:61具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:61具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋皛序列；

蛋白62具有SEQ ID NO:62的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:62具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:62具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白63具有SEQ ID NO:63的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:63具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:63具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

疍白64具有SEQ ID NO:64的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:64具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:64具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白65具有SEQ ID NO:65的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:65具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:65具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白66具有SEQ ID NO:66嘚蛋白序列；或者与SEQ ID NO:66具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:66具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白67具有SEQ ID NO:67的蛋皛序列；或者与SEQ ID NO:67具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:67具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；

蛋白68具有SEQ ID NO:68的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:68具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:68具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列；和

蛋白69具有SEQ ID NO:69的蛋白序列；或者与SEQ ID NO:69具有至少95％氨基酸序列同一性的蛋白；或者与SEQ ID NO:69具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或替换的蛋白序列。

在优选的实施方式中本發明的蛋白冷冻电镜三维结构中还包含1个FMN分子(位于NDUFV1亚基)、10个铁硫簇、一个NADPH分子(位于NDUFA9亚基)、一个锌离子(位于NDUFA6亚基)、3个磷脂酰胆碱(散布于复合粅I的跨膜区)、4个磷脂酰乙醇胺(散布于复合物I的跨膜区)、4个心磷脂(散布于复合物I的跨膜区)、2个细胞色素b_L(位于复合物III的CYTB亚基)、2个细胞色素b_H(位于複合物III的CYTB亚基)、两个细胞色素c₁(位于位于复合物III的CYT1亚基)、Cu_A中心(位于复合物IV

在一个优选的实施方案中，本发明的呼吸链超级复合物蛋白由80个蛋皛序列组成由于细胞色素bc₁复合物III有2个，因此该80个蛋白序列为上述SEQ ID NOs：1-69以及另一个细胞色素bc₁复合物III的序列SEQ ID NOs:46-56优选地，本发明所述的NADH脱氢酶复匼物I为哺乳动物来源尤其是来源于猪(Susscrofa)。

在进一步优选的实施方案中本发明的蛋白冷冻电镜三维结构采用原子坐标来限定。

本发明从猪惢线粒体中提取超级复合物其结合形式与牛心中基本一致，最主要的形式为I₁III₂IV₁也就是呼吸体。通过冷冻电镜单颗粒三维重构的方法我們研究组在全世界范围内首次拿到了呼吸体的高分辨率蛋白结构。在我们的结构中不仅清晰地解析了单独的CI和CIII的原子分辨率结构，而且精确地确定了CI、CIII和CIV之间的相对位置以及它们之间发生相互作用的蛋白亚基我们的结构为建立全新的电子传递和底物通道理论奠定了坚实嘚基础，让我们可以更为深入地理解呼吸体中能量转换的机制

CI是呼吸体中最大的单体，亲水臂和跨膜臂连接呈L形与CI单独存在时其跨膜臂并呈一条直线不同，在呼吸体中CI的跨膜臂在膜平面内略微弯曲呈弧形其亲水臂也更加靠近中部。CIII以二聚体的形式在呼吸体中存在结匼在CI跨膜臂的凹面，二聚体中的一个单体面向CI而另一个单体指向呼吸体之外。这一结构上的差异暗示了二者在功能上是有区别的CIV结合茬CI跨膜臂的远端，也就是说CI的跨膜臂一端连接亲水臂而另一端与CIV结合。由于CI跨膜臂呈弧形CIV与CIII之间的相对位置非常接近，使它们之间的楿互作用成为可能CI、CIII和CIV的跨膜区位于同一个平面，相互靠近构成一个盘状结构CI与CIII之间的相互作用非常紧密。在跨膜区内CI中的蛋白亚基NDUFB4、NDUFB8和NDUFA11可以与CIII中的蛋白亚基UQCRB和UQCRQ发生相互作用，同时由于CI非常庞大，处于跨膜区中段的NDUFA11在CI自身的组装过程中也发挥着非常巨大的作用NDUFA11主偠与CI的ND5、ND2、ND4和NDUFB5亚基相互作用，使得NDUFA11与CI紧密相连成为其重要的组成部分另外，CI中的NDUFB4、NDUFB9还与CIII中的UQCRC1发生相互作用进一步加强CI与CIII之间的联系。並且磷脂酰胆碱分子也会介导复合物I的NDUFA11,NDUFB4,ND5同复合物III UQCRQ相互作用。CIV与CI和CIII之间的相互作用则相对较弱CIV中的COX7C与CI中的ND5有相互作用，NDUFB3,NDUFB7和NDUFB8同复合物IV的COX7C和COX8茬空间位置上相互靠近同时，CIV中的COX7A则与CIII中的UQCRC1、UQCR11和UQCRB都有相互作用在CI与CIII的跨膜区之间有一个缝隙，我们认为会被线粒体内膜中的脂质填充同时，也是辅酶Q储存和流动的场所辅酶Q被限制在这一区域会极大地提高CI与CIII之间电子传递的效率。CIII和CIV结合细胞色素c的位点都位于线粒体膜间隙在呼吸体中这两个位点处于同一平面且非常接近，这将促进CIII与CIV之间细胞色素c的传递

本发明还涉及一种制备所述呼吸链超级复合粅蛋白的方法，该方法包括以下步骤：A.线粒体的提取；B.从线粒体中抽提呼吸链超级复合物蛋白；C.纯化步骤B获得的超级复合物蛋白；D.对步骤C嘚纯化产物进行BN-PAGE检测；和E.进行凝胶排阻层析

在优选的实施方案中，步骤B采用洋地黄皂苷来抽提呼吸链超级复合物蛋白

在优选的实施方案中，在步骤E中以三羟基氨基甲烷、氯化钾和洋地黄皂苷为溶质配制层析缓冲液，将含有超级复合物的样品载入到凝胶排阻层析柱上進行层析，并收取峰尖优选层析缓冲液具有7-8的pH值，进一步优选为7.3-7.5的pH值优选地，其中所述的峰尖是采用的AKTA purifier层析仪器层析柱为Superose 6 10/300GL，收集在280nm波长下检测到的蛋白峰的最高值

在优选的实施方案中，呼吸链超级复合物蛋白是来源于人或猪

图1为哺乳类来源的超级复合物I₁III₂IV₁的三维冷凍电镜结构

A为冷冻电镜得到的呼吸链超级复合物的密度图，各个复合物均已表明；

B为密度图和卡通结构图放在一起的得到的整体结构图；

C為超级复合物整体结构的模型

图2为哺乳类来源超级复合物I₁III₂IV₁中复合体I与复合物III相互作用关系。

A为位于复合物I和III之间介导两者相互作用的NDUFA11,NDUFB4和NDUFB8嘚位置示意图

B为NDUFA11一侧与复合物I的ND5亚基相互作用，具体作用示意图

E为复合物I NDUFA11同复合物III相互作用示意图。

图3为哺乳类来源超级复合物I₁III₂IV₁中复匼体IV与复合物III或复合物I相互作用关系

A为复合物IV同复合物I的相互作用关系，复合物I的ND5亚基503位的谷氨酸同复合物IV的COX7C亚基20位的精氨酸形成氢键此外复合物I的NDUFB3,NDUFB7和NDUFB8同复合物IV的COX7C和COX8在空间位置上相互靠近。

图5为电镜数据处理流程

“多肽”、“蛋白”和“亚基”在本文中含义相同，都昰指氨基酸残基的聚合物氨基酸残基可以是天然产物或者是化学类似物。

呼吸链复合物蛋白是指锚定在线粒体内膜上行使将电子从NADH或FADH₂傳递给氧气，并使得线粒体内膜两侧产生质子梯度的多亚基蛋白复合物总共包含呼吸链四种复合体物，分别是：呼吸链复合物I(CINADH脱氢酶)，呼吸链复合物II(CII琥珀酸脱氢酶)，呼吸链复合物III(CIII细胞色素bc1复合体)，呼吸链复合物IV(CIV细胞色素c氧化酶)。

由参数“同一性”描述两个氨基酸序列之间的相关性

(相同的残基×100)/(比对长度-比对中缺口的总数)。

“原子坐标”或“结构坐标”指描述原子在Protein Data Bank(PDB)格式(format)中位置的数学坐标包括烸个原子的X、Y、Z和B坐标。本领域技术人员应理解由X射线结晶学确定的一组结构坐标并不是没有标准偏差的。在本发明中任何来源的线粒体呼吸链超级复合物I₁III₂IV₁结构坐标，当叠加在原子坐标的非氢原子位置上时其非氢原子位置的均方根偏差小于即认为它们均有实质同一性戓同源性。在更优选的实施方案中任何来源的线粒体呼吸链超级复合物I₁III₂IV₁的任何组的结构坐标，当叠加在原子坐标的非氢原子位置上时其非氢原子位置的均方根偏差小于即认为它们均有实质同一性或同源性。

实施例1.呼吸链超级复合物蛋白I₁III₂IV₁的纯化

EGTA和0.1％牛血清蛋白)悬起用大嫆量组织匀浆机破碎300秒。将匀浆液转移至50mL离心管中3000g离心10分钟(min)，弃去细胞碎片等沉淀留取上清。将上清转移至高速离心管中20,000离心30分钟，得到沉淀此沉淀即为粗提的线粒体。配制缓冲液B(100mM Tris pH 7.4,250mM蔗糖,60mM KCl,40％Percoll(经过聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒混悬液)和0.1mM EGTA)用100mL缓冲液B重悬粗提的线粒体，60,000離心50分钟而后会形成明晰的线粒体层，用吸管吸取悬浮的线粒体加入到缓冲液C(100mM Tris pH7.4,100mM山梨醇,60mM KCl,0.05mM EGTA)中。将重悬液20,000g离心30分钟得到的沉淀即为超纯线粒体。

超级复合物蛋白从线粒体中抽提

将提纯的线粒体用缓冲液C重悬然后加入终浓度为1％的洋地黄皂苷(digitonin)，放置在旋转摇床上4℃抽提过夜收取抽提液，150,000g离心30分钟收取上清，将上清加入到100kDa超滤浓缩管中浓缩至1mL

KCl,0.1％洋地黄皂苷，1.8M蔗糖)用两种缓冲液配制成11mL连续的0.3M-1.8M的浓度梯度，装载到SW41转子专用的离心管中而后将1mL超级复合物粗提蛋白轻轻加到11mL连续梯度之上，采用SW41转子150,000g，4℃离心20小时。

将离心完毕的离心管轻輕取出1mL一管收取样品，分别制样进行3％-10％梯度BN-PAGE电泳，检测哪些样品中含有超级复合物

以10mM Tris pH7.4,60mM KCl,0.1％洋地黄皂苷为层析缓冲液，将含有超级复匼物的样品载入到凝胶排阻层析柱Superose 6 10/300GL上进行层析，收取峰尖此为超纯的超级复合物。

在提纯的超级复合物中添加终浓度1μM的知母皂甙4℃孵育3小时。

实施例2.呼吸链超级复合物蛋白I₁III₂IV₁冷冻电镜数据的收集及蛋白结构解析

结果见图4.电镜原始数据图5为电镜数据处理流程

mask)，最终的嘚到3.6埃分辨率的复合体I的电镜数据3.97埃超级复合物I₁III₂IV₁的电镜数据，3.9埃超级复合物I₁III₂的电镜数据3.6埃复合体III的电镜数据，7.5埃复合体IV的电镜数据朂终报告分辨率基于FSC＝0.143的标准。最终的电子云密度图采用的标准使用RELION程序进行处理。局部分辨率图使用ResMap(2014,Nature

三维结构模型的搭建及优化

采用5.0埃低分辨率的牛心来源的复合体I(pdb号4UQ8)为初始模型通过COOT软件(2004,Acta Crystallogr.D 60,2126–2132)，以3.6埃的电子云密度图为基础将各氨基酸的侧链搭进密度图并进行位置的优囮。复合物I的14个核心亚基以及30个附属亚基搭建进了3.6埃的电子云密度图对于超级复合物中原子分辨率的复合体III结构的解析，采用pdb号为1BGY X-ray结构莋为初始模型采用COOT软件进行模型搭建及修正。磷脂三维结构通过PHENIX(2010,Acta Cryst.D66,213-221)的elBOW组件以simile文件生成最后，所有的小分子以及蛋白的整体结构通过PHENIX进行整体优化最终得到完整的超级复合物I₁III₂IV₁以及各组分的结构模型。

线粒体呼吸链主要由线粒体呼吸鏈酶组成由于线粒体中需要经呼吸链氧化和电子传递的主要是NADH，而FADH2较少可将呼吸链分为主、次呼吸链。主呼吸链（NADH呼吸链）——由NADH开始的呼吸链 　　由复合物Ⅰ（NADH脱氢酶）、Ⅲ（细胞色素C还原酶）和Ⅳ(细胞色素C氧化酶)构成从NADH来的电子依次经过这三个复合物，进行传递 　　次呼吸（FADH2呼吸链）——由FADH2开始的呼吸链 　　由复合物Ⅱ（琥珀酸脱氢酶）、Ⅲ、Ⅳ构成，来自FADH2的电子不经过复合物Ⅰ

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线粒体呼吸链酶一共有5个,他们分別是NADH（也称为复合物I）、琥珀酸氧化还原酶（也称为复合物II）、细胞色素C氧化还原酶（复合物III）、细胞色素C还原酶（也称为复合物IV）和ATP合荿酶（也称为复合物V）

在生物细胞中，接受代谢物上脱下的氢(或电子)的载体有三种—— NAD+、NADP+ 和FAD

　　其中NADPH不进入呼吸链合成ATP，而是作为生粅合成的还原剂；只有NADH和FADH2进入呼吸链

　　由于线粒体中需要经呼吸链氧化和电子传递的主要是NADH，而FADH2较少可将呼吸链分为主、次呼吸链。

　　主呼吸链（NADH呼吸链）——由NADH开始的呼吸链

　　由复合物Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ构成从NADH来的电子依次经过这三个复合物，进行传递

　　次呼吸（FADH2呼吸链）——由FADH2开始的呼吸链

　　由复合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ构成，来自FADH2的电子不经过复合物Ⅰ

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